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Nrf2 activators from nature

screening and investigation of a potential crosstalk between

Johannes Baldinger

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Verena Dirsch

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URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-30297.30823.596770-5

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2) ist ein Transkriptionsfaktor, der neben Adenosin Monophosphat aktivierter Proteinkinase (AMPK) den Mittelpunkt dieser Arbeit darstellt. Nrf2 wird durch oxidativen Stress aktiviert und führt zu gesteigerten Expressionsraten einer Vielzahl von Phase II Entgiftungs-Proteinen wie Hämoxygenase 1 (HO-1). Die Aktivierung von Nrf2 induziert antioxidative, antientzündliche und in weiterer Folge antitumorale Mechanismen. Somit ist Nrf2 ein wichtiger Bestandteil der Zelle im Kampf gegen zellulären Stress. Oxidativer Stress bzw. Entzündungen beeinflussen metabolisch bedingte Erkrankungen wie Diabetes mellitus Typ 2 oder Lebersteatose nachweislich negativ, daher könnten Nrf2 aktivierende Stoffe ein vielversprechendes Arzneimitteleinsatzgebiet zur Vorbeugung bzw. Linderung dieser Krankheiten darstellen. AMPK ist entscheidend am Energiehaushalt einer Zelle beteiligt und reagiert auf Änderungen im AMP-/ATP-Verhältnis. Aktivierte AMPK steht in Verbindung mit einer Vielzahl von positiven Eigenschaften wie z.B. Reduzierung von Hyperglykämie, gesteigerter Fettsäure Oxidation, Verringerung von Entzündungsprozessen, reduziertem Redox Stress und verminderten Zellteilungsraten. Aktivierte AMPK hat somit auch antikanzerogene Effekte. Aufgrund sich überschneidender Eigenschaften ist eine gegenseitige Beeinflussung von AMPK und Nrf2 in Betracht zu ziehen. Erstes Ziel dieser Arbeit war es, die Aktivierung von Nrf2 durch Extrakte aus fünf unterschiedlichen Pflanzen auszutesten, um dabei neue potentielle Nrf2-Aktivatoren zu erhalten. Es handelte sich dabei um Pflanzen, die in der lateinamerikanischen Volksmedizin gegen Fettleibigkeit und Entzündungen eingesetzt werden. Keines der getesteten Extrakte zeigte schlussendlich die vermutete Nrf2-Aktivierung. Ein weiterer Fokus dieser Arbeit lag auf der Untersuchung der Interaktion von Nrf2 und AMPK. Es wurde mit Xanthohumol (XN), ein prenyliertes Chalkon aus Humulus lupulus, gearbeitet, welcher Nrf2 aktiviert. Durch die Wiederholung vorangegangener Experimente wurde bewiesen, dass XN in Maus embryonalen Fibroblasten (MEF) die HO-1-Expression antreibt. Hingegen wurden in Nrf2 ko Zellen keine und in AMPK ko Zellen nur verminderte HO-1 Spiegel produziert. Demzufolge ist die HO-1-Expression streng Nrf2 abhängig, wobei in Anwesenheit von AMPK eine zusätzliche Steigerung der HO-1-Expression stattfindet. In einem weiteren Experiment wurde durch quantitative Echtzeit polymerase Kettenreaktion (qRT-PCR) von HO-1 mRNA festgestellt dass AMPK seinen Einfluss auf Nrf2 bereits zum Zeitpunkt der Transkription ausübt. Weitere Untersuchungen sollten zeigen, welche spezifischen Mechanismen durch AMPK ausgelöst werden und somit zu einer gesteigerten Nrf2-Aktivität führen. Dazu wurde mit der Nrf2 aktivierenden Substanz XN in MEF-Zellen ein Lumineszenz Assay durchgeführt, um sich ändernde ATP-Spiegel festzustellen. Die Ergebnisse waren jedoch nicht signifikant. Im letzten Versuch dieser Arbeit testete man mittels XN stimulierten MEF-Zellen im Zuge einer Durchflusszytometrie auf sich ändernde Superoxid-Spiegel. In den Ergebnissen zeigte sich, dass XN die in den Mitochondrien stattfindende oxidative Phosphorylierung unterbricht. Es kommt daher einerseits zu gesteigerten Superoxid-Spiegeln und anderseits zu Änderungen in den ATP-Vorräten der Zelle. Ob dieser Effekt jedoch für die zusätzliche Aktivierung von Nrf2 durch AMPK verantwortlich ist, bleibt weiters unbekannt.

Abstract

(Englisch)

Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2) is a major transcription factor involved in the defense against cellular stress, and well known for playing a crucial role in homeostasis of a cell. A multitude of positive effects such as antitumor, antioxidant, anti-inflammatory activities, even prolonged live span have been linked to activation of Nrf2. Recent studies also implicate its effectiveness against metabolic diseases like diabetes mellitus type 2, tumorigenesis or liver steatosis. Therefore, activators of Nrf2 may be promising drug candidates for alleviating or preventing these diseases. AMP-activated protein kinase (AMPK) is a master switch in cellular regulation of metabolism and responsive to the AMP/ATP ratio. Activation of AMPK is linked with multiple beneficial effects such as reduced hyperglycemia, increased fatty acid oxidation, reduced inflammation, reduced redox stress or reduced proliferation. These activities partly overlap with the outcome of Nrf2 activation. In this work we first focused on extracts of five different plants that are used as traditional medicine in Latin America against obesity and/or inflammation. They were screened in a reporter gene assay for Nrf2 activation in order to possibly find novel Nrf2 activators or to provide a molecular explanation for the traditional use of the plants. However, none of the tested extracts showed promising Nrf2 activation. Secondly we examined a potential crosstalk between Nrf2 and AMPK. We set out to investigate whether the Nrf2 activator Xanthohumol (XN) a prenylated chalconoid found in humulus lupulus and furthermore in beer, is able to activate Nrf2 in an AMPK-dependent manner. For this we checked expression of HO-1 (as exemplary Nrf2 target gene) in WT and AMPK ko cells after XN exposure. XN induced HO-1 over time in a strictly Nrf2-dependent manner, an effect that was enhanced when AMPK was present. Presence of AMPK raised both HO-1 mRNA (assessed by qRT-PCR) and HO-1 protein (assessed by Western Blot) expression in XN-treated cells, indicating a positive influence of AMPK at a step prior to transcription of HO-1. Looking for the mechanism underlying the apparent activation of AMPK by XN, we were not able to observe changes in cellular ATP levels (assessed by a luminescence-based assay). But we saw increased mitochondrial superoxide levels in cells treated with XN, which could indicate an impaired mitochondrial electron transport chain. Overall, there is crosstalk between Nrf2 and AMPK in XN-treated cells. The detailed molecular mechanisms need further investigation.

Autor*innen

Johannes Baldinger

Haupttitel (Englisch)

Nrf2 activators from nature

Hauptuntertitel (Englisch)

screening and investigation of a potential crosstalk between

Publikationsjahr

2013

Umfangsangabe

84 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Verena Dirsch

Klassifikation

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.30 Naturwissenschaften in Beziehung zu anderen Fachgebieten

AC Nummer

AC11347477

Utheses ID

28082

Studienkennzahl

UA | 449 | | |

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