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The mechanism of plasma-membrane as well as endoplasmic reticulum resident ion channels in Ca 2+ signalling

Maria Christine Riedl

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Christoph Romanin

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DOI

10.25365/thesis.31643

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29239.73701.321160-2

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Meine Diplomarbeit beschäftigt sich mit der Regulation zellulärer Prozesse durch Kalzium über 3 verschiedene Signalisierungswege. Kalzium stellt einen der wichtigsten Mineralstoffe des menschlichen Körpers dar. Unter anderem dient er als Baustein von Knochen und Zähnen und übt dort wichtige Stützfunktionen aus. Dieser lebenswichtige sekundäre Botenstoff ist an verschiedensten Signalwegen beteiligt, in fast allen Zelltypen vertreten und steuert ein breites Spektrum von zellulären Prozessen. Beispielsweise ist Kalzium im Nervensystem, bei der Übermittlung von Impulsen, im Herzen, an der Regulation des regelmäßigen Herzschlags wie auch an der Gentranskription beteiligt. Kalzium gelangt über Poren, den sogenannten Ionenkanälen in die Zellmembran in die Zelle. Diese Transmembranproteine ermöglichen, elektrisch geladenen Teilchen, das Durchqueren der Zellmembran. In dieser Diplomarbeit habe ich Ionenkanäle, welche vorwiegend für Kalzium selektiv sind mittels der Kalzium-Imaging Technik analysiert. Hiermit kann die Kalziumkonzentration in der Zelle direkt anhand seiner Fluoreszenzfärbung festgestellt werden. Der erste Teil meiner Arbeit befasst sich mit der Charakterisierung von Kalzium-Kanal-Blockern bezüglich ihrer Wirkung auf den sehr wichtigen speicherregulierten Kalzium-Einstrom-Weg, dem sogenannten „Calcium release-activated Calcium“-Weg (CRAC). Dieser wird durch die beiden Schlüsselkomponenten STIM1 und Orai1 vollständig rekonstituiert. Das Protein STIM1 (Stromal Interaction Molecule 1) dient als Kalzium Sensor im ER. Sinkt die Kalziumkonzentration im ER, koppelt es an ORAI1 dem CRAC-Ionenkanal und gelangt durch diesen in die Zelle. Die Kalzium-Kanal-Blocker der Firma Glaxo Smith Kline (GSK)wurden auf die beiden Proteine STIM1/Orai1 ausgetestet. Um einen indirekten Einfluss auf STIM1 und Orai1 auszuschließen, wurde zuerst die Wirkung der Blocker auf die Speicherentleerung in Zellen ohne künstlich eingebrachten Proteinen ausgetestet. Nachdem dies jedoch unbeeinflusst blieb, kann ein indirekter Einfluss auf STIM1/Orai1 ausgeschlossen werden. Ich konnte weiter feststellen, dass der zellspezifische CRAC-Strom gehemmt wurde, in Korrelation zu den Resultaten meiner Kollegen an künstlich eingebrachten STIM1/Orai1-Proteinen. Im zweiten Thema beschäftigte ich mich mit der Regulation eine Gruppe von ligandengesteuerten Ionenkanälen, den sogenannten transient receptor potential channels auseinander insbesondere (TRPC1, canonical) und (TRPV6, vanilloid). Ich zeigte einerseits, dass TRPC1 allein nach der Speicherentleerung keinen Kalzium-Einstrom in die Zellen zeigte. Andererseits wies ich nach, dass TRPC1 den durch TRPV6 induzierten Kalzium Einstrom in die Zelle reduziert. Dies deutet auf eine mögliche Koregulation von TRPV6 und TRPC1 hin, welche durch Patch-Clamp- und FRET-Experimente meiner Kollegen bestätigt wurden. Im letzten Thema setzte ich mich damit auseinander, dass Mutationen im kardialen Ryanodin-Rezeptor (RyR2) zu einer erhöhten Öffnungswahrscheinlichkeit des RyR2 beitragen, die zu einer spontanen Kalzium-Freisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum (SR) führen. In Folge kann es zu ventrikulären Tachykardien bis hin zum plötzlichen Herztod kommen. Die Zellen versuchen die Konzentration an intrazellulärem Kalzium möglichst gering zu halten, jedoch Mutationen können zu einem abnormen intrazellulären Kalzium Anstieg führen. Ich untersuchte HEK293 Zellen mit RyR2 mit und ohne seinen Bindungspartner RTN1A. In Gegenwart dieses Bindungspartners verminderte sich die Freisetzung von Kalzium. Dies deutet auf einen möglichen inhibitorischen Effekt von RTN1A auf die RyR2 Aktivität hin. Zusammenfassend liefern meine Resultate zur Funktion verschiedener Kalzium-Ionenkanäle einen wichtigen Beitrag zum grundlegenden Verständnis von Kalzium Signalisierungswegen.

Abstract

(Englisch)

In my diploma thesis I studied three different calcium signaling mechanisms in the human cell. Calcium is one of the most important mineral substances of the human body. It is found in bones and teeth in order to fulfils supporting functions. This essential second messenger functions as a main player in different signaling cascade pathways, in almost all cell types and regulates a wide spectrum of cellular processes. Calcium is for example involved in the nervous system, where it triggers impulses, in the heart for the regulation of the periodic heart beat, as well as in genetic transcription. Calcium enters the cell via pores in the cell membrane, the so-called ion channels. These transmembrane proteins enable electrically charged particles to move across the cell membrane. In this diploma thesis I analyzed in particular ion channels, which are mainly calcium selective utilizing the Calcium-Imaging Technique. This technique enables to measure the intracellular calcium concentration directly via a fluorescence dye, which changes emission wave length and intensity in dependence of the calcium concentration. In the first part of my work I characterized calcium-channel-blockers regarding their effects on the calcium release-activated calcium (CRAC) channel. This channel is fully reconstituted by the two key players STIM1 and Orai1. The protein STIM1 is the calcium sensor of the ER. If the calcium concentration in the ER decreases, STIM1 couples to Orai1, the CRAC-ion channel and lets calcium pass into the cell. The calcium-channel blockers of the company Glaxo Smith Kline (GSK) were tested on the both proteins STIM1/Orai1. To exclude, that these substances inhibit CRAC/ STIM1-Orai1 currents indirectly, I tested their effects on cells containing no artificially introduced proteins for influence on intracellular calcium levels upon calcium store depletion in dependence of the blockers. No influence could be detected, suggesting that an indirect effect on CRAC/ STIM1-Orai1 can be excluded. In addition I detected that cell-specific CRAC entry was reduced by the blockers, in correlation with the diminished calcium currents of STIM1/Orai1 proteins. In the second part I dealt with the regulation of ligand-gated ion channels, the transient receptor potential channels, in particular (TRPC1, canonical) and (TRPV6, vanilloid). On the one side TRPC1 alone showed after the store-depletion no calcium entry into the cell. On the other side I demonstrated that TRPC1 co-expressed with TRPV6 induces a reduced calcium influx into the cell. This shows a possible co-regulation of TRPV6 with TRPC1, which confirms the results of my colleagues employing the patch-clamp- and FRET-experiments. In the last part I investigated mutations in the cardiac ryanodine-receptor (RyR2), which can lead to a higher open probability of the RyR2 channel as well as a spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum (SR). In consequence it can lead to ventricular tachycardia (VT) and finally also to sudden death. The cells try to keep a low intracellular concentration, but the mutations can trigger an abnormal sarcoplasmic reticulum calcium increase. I investigated HEK293 cells with RyR2 alone or co-expressed with RTN1A. In the presence of RTN1A a decreased calcium release via RyR2 was detected. The results indicate an inhibitory effect of RTN1A on the RyR2 activity. Summing up my results display a significant contribution to the function of different ion channels and to the basic knowledge of calcium signaling pathways.

Autor*innen

Maria Christine Riedl

Haupttitel (Englisch)

The mechanism of plasma-membrane as well as endoplasmic reticulum resident ion channels in Ca 2+ signalling

Paralleltitel (Deutsch)

Die Beteiligung von membranständigen wie auch intrazellulären Ionenkanälen am Calcium Signalling

Paralleltitel (Englisch)

The mechanism of plasma-membrane as well as endoplasmic reticulum resident ion channels in Calcium Signalling

Publikationsjahr

2014

Umfangsangabe

92, [35] S. : Ill., graf. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Christoph Romanin

Klassifikation

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.03 Methoden und Techniken in den Naturwissenschaften

AC Nummer

AC11415253

Utheses ID

28135

Studienkennzahl

UA | 449 | | |

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Schlagwörter