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Structural insights into the human telomerase RNA
Georgeta Doina Zemora
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Christina Waldsich
Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29954.52150.863763-4
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Die Telomerase ist ein Ribonukleoprotein (RNP) Komplex, welcher die sich vielfach wiederholende Telomersequenz am Ende der Chromosomen synthetisiert, um so dem Problem der kürzer werdenden DNS entgegen zu wirken. Für die katalytische Aktivität dieses RNPs ist sowohl die Telomerase Reverse Transkriptase (TERT) also auch die integrale Telomerase RNS Komponente (TR) notwendig. TERT nutzt die TR hierbei als Vorlage für die Synthese einer hexameren sich wiederholenden Sequenz am Ende der Chromosomen. Neben der Vorlagesequenz ist es notwendig, dass die TR einige strukturelle Elemente für die Aktivität der Telomerase und die Bindung an TERT enthält. In letzter Zeit ist die Telomerase in den Blickwinkel der medizinischen Forschung gekommen, da dieses Enzym in vielen Krebsarten hochreguliert ist und Mutationen in den Bestandteilen der Telomerase im Zusammenhang mit vielen Krankheiten stehen. Trotz der bio-medizinischen Bedeutung des Telomerase- Komplexes ist die Struktur und dessen Rolle noch größtenteils unbekannt. Aufgrund des fundamentalen Zusammenhangs zwischen Struktur und Funktion ist es insbesondere wichtig die Faltung der RNS zu verstehen. Aus diesem Grund sind wir daran interessiert die Struktur- und Faltungslandschaft der humanen telomerase RNS (hTR) in vivo zu entschlüsseln und die, durch das humane TERT (hTERT)-induzierten, Konformationsänderungen innerhalb der hTR zu charakterisieren. Da die zelluläre Umgebung sehr stark von den künstlichen Faltungsbedingungen in vitro abweicht ist es unser Ziel die Telomerase RNS im Säugetierzellsystem zu untersuchen. Dafür verwenden wir in vivo ‚DMS chemical probing‘ in HEK Zellen, welche es uns ermöglicht interessante Einsichten in die sekundäre und tertiäre Struktur von hTR zu erhalten als auch Hinweise auf mögliche Interaktionsstellen zwischen hTR und hTER. Wir haben gezeigt, dass der Pseudoknoten in vivo eine stabile Faltung eingeht, unabhängig von hTERT. hTERT ist bekannt dafür sowohl den Pseudoknoten als auch die CR4/CR5 Domäne von hTR zu binden. Tatsächlich weisen die DMS Modifikationsmuster der gesamten hTRs daraufhin, dass hTERT mit dem P6.1 Stamm interagiert sowie mit dem neben an gelegenen Knotenpunkt J6.1/5 und dem terminalen Basenpaares des P6b des CR4/CR5 Elements. Jedoch lassen diese Daten nicht eindeutig auf die Bindestellen innerhalb der Pseudoknoten/Kern Domäne schließen. Des Weiteren hat die DMS Strukturaufklärung von hTR gezeigt, dass einige Us und Gs in hTR methyliert werden, obwohl DMS normalerweise nur As und Cs methyliert. Interessanterweise sind einige dieser Us an Stellen, die potentielle Ziele für Pseudouridinierung sind und somit Hinweise darauf geben, dass überexpremiertes hTR in vivo posttranskriptionell modifiziert wird. Unser hauptsächliches Interesse galt der Identifikation der strukturellen Veränderungen, die durch genetische Krankheiten in hTR induziert werden. Diese hTR Mutationen wurden in Patienten gefunden, welche sowohl an Dyskeratosis congenita, Aplastische Anemie und Pulmonärer Fibrose leiden und an eine fehlerhafte Funktion der Telomerase zeigen. Aus diesem Grund haben wir untersucht wie diese krankheitsbezogenen Mutationen die Faltung von hTR in einem Säugetierzellsystem verändert. Mutationen innerhalb des konservierten P2b/P3 Pseudoknotens haben gezeigt, dass nicht nur der Pseudoknoten aufgelöst wird sondern auch die strukturelle Organisation der Vorlagesequenz stört. Außerdem scheinen die pathologischen Mutationen die Bindung von hTERT zur CR4/CR5 Domäne von hTR nicht zu beeinflussen. Dies lässt vermuten, dass der Verlust der katalytischen Aktivität der mutierten Telomerase nicht durch die Störung des RNP-Komplexes sondern durch die Störung der Pseudoknotenstruktur zu Stande kommt. Diese spielt eine kritische Rolle bei der Positionierung der Vorlagesequenz an das aktive Zentrum des Komplexes. In Anbetracht dieser Erkenntnisse ist zu erwähnen, dass die Aplastische Anemie zugehörige Mutation in der stark konservierten Region P6.1 der CR4/CR5 Domäne weder den Stamm zerstört noch andere Segmente der hTR beeinflusst. Deshalb ist anzunehmen, dass Defekte der Telomeraseaktivität in dieser Mutante möglicherweise die Schlüsselelemente der Interaktion von hTERT beeinflussen. Unsere Ergebnisse verfeinern die vorhergesagte hTR Struktur und dessen Bedeutung für diese Krankheiten.
Abstract
(Englisch)
Telomerase is a ribonucleoprotein (RNP) complex that synthesizes multiple telomeric DNA repeats at the end of the chromosome, to counteract for the loss of sequence due to the DNA end replication problem. The key components for the catalytic activity of repeat synthesis are the telomerase reverse transcriptase (TERT) and its integral telomerase RNA component (TR). TR provides the template that is used by TERT to synthesize the hexameric repeats at the end of the chromosomes. Besides providing the template, TR contains several structural elements that are important for TERT binding and crucial for telomerase activity. Telomerase has become the focus of medical research because telomerase is upregulated in the vast majority of cancers and mutations in the telomerase components have been associated with a large spectrum of premature ageing diseases. Despite its bio-medical importance, the structure of the human telomerase complex remains largely enigmatic. Since understanding an RNA’s fold is instrumental in understanding its function, we are interested in exploring the structure and folding landscape of human telomerase RNA (hTR) in vivo and to characterize the human TERT (hTERT)-induced conformational changes within hTR. The cellular compartment differs significantly from the artificial in vitro refolding conditions. Therefore, it is our goal to explore the telomerase RNA structure in a mammalian cell system by employing an in vivo chemical probing technique. Using in vivo DMS probing in HEK cells, we obtained interesting insights on the hTR structure both at the secondary and tertiary structure level and identified possible hTERTinteraction sites. We showed that the pseudoknot forms stably in vivo independent of hTERT. hTERT is known to bind both the pseudoknot and CR4/CR5 domains of hTR. In fact, the DMS modification pattern of the full-length hTR suggested that hTERT interacts with the P6.1 stem, adjacent junction J6.1/5 and the terminal base-pair of the P6b of the CR4/CR5 element, while it does not allow to draw any conclusion about its binding site within the pseudoknot/template domain. DMS structural probing of hTR identified several Us and one G that are uncommonly methylated by DMS. Interestingly, some of the methylated Us were observed for positions that were identified as pseudouridines indicating that in vivo overexpressed hTR undergoes posttranscriptional modifications. Moreover, we were interested in determining the structural basis underlying genetic diseases associated with mutations in hTR. These hTR mutations are found in patients suffering from dyskeratosis congenita, aplastic anemia and pulmonary fibrosis and they were shown to impair the telomerase activity. We therefore addressed how these disease-associated mutations interfere with folding of hTR in a mammalian cell system. Mutations within the conserved P2b/P3 pseudoknot not only disrupt the pseudoknot but also prevent structural organization of the template; however these disease-linked mutations does not affect binding of hTERT to the CR4/CR5 domain of hTR. This suggests that loss of the catalytic activity of the mutant telomerase is not caused by disruption of the RNP complex, but due to the disruption of the pseudoknot structure formation that is believed to position the template at the active site at the telomerase. In contrast, the aplastic anemia-linked mutation in the very conserved P6.1 stem of the CR4/CR5 domain does not disrupt this stem, nor affects other segments of hTR. Therefore defects in telomerase activity reported for this mutant might reside in its interaction with key elements of hTERT that are important for telomerase enzymatic activity. Our results refine both the predicted hTR structure and its relevance to human disease.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
Telomerase RNA folding DMS probing
Schlagwörter
(Deutsch)
Telomerase RNA Faltung DMS
Autor*innen
Georgeta Doina Zemora
Haupttitel (Englisch)
Structural insights into the human telomerase RNA
Paralleltitel (Deutsch)
Strukturelle Einsichten in die humane Telomerase RNA
Publikationsjahr
2014
Umfangsangabe
XIII, 210, VIII S. : Ill.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Benoit Masquida ,
Renee Schroeder
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC12012528
Utheses ID
28200
Studienkennzahl
UA | 091 | 490 | |
Universität Wien, Universitätsbibliothek, 1010 Wien, Universitätsring 1