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The SWI/SNF complex regulates the Prdm protein Hamlet to ensure lineage directionality in Drosophila neural stem cells

Elif Eroglu

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Jürgen Knoblich

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URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29178.65412.600962-3

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Die direkte Nachkommenschaft einer Stammzelle besteht oftmals aus einer transienten Population von Vorlaeuferzellen, die sogenannten transit amplifying Zellen (TA-Zellen). Diese Zellen durchlaufen mehrere Zellzyklen und koennen so in kurzer Zeit eine große Anzahl von Nachkommenzellen erzeugen. Waehrend die Faehigkeit zur Zellteilung bei gleichzeitiger Erhaltung der Identitaet bei Stammzellen als unlimitiert angesehen wird, muss dies in den TA-Zellen limitiert werden, um eine unkontrollierte Proliferation zu verhindern. Wenn man also die Rolle verstehen moechte die Stammzellen bei der Tumorgenese spielen, muessen die Mechanismen untersucht werden, die die unidirektionale Progression von einer unlimitierten ueber eine limitierten Faehigkeit zur Zellteilung bis hin zur terminalen Differenzierung kontrollieren. Einige Mitglieder aus dem SWI/SNF Komplex, ein Proteinkomplex der in die Remodellierung von Chromatin involviert ist, gehoeren zu den am meisten mutierten Genen in humanen Krebsen. Es wurde gezeigt, dass der SWI/SNF Komplex eine Rolle bei der Kontrolle der Selbsterhaltung der Stammzellidentitaet und Differenzierung spielt; inwiefern dies allerdings zur Entstehung von Krebs fuehren kann ist noch unklar. In der vorliegenden Arbeit nutzen wir neuronale Stammzellen, sogenannte Neuroblasten, aus der Fruchtfliege Drosophila melanogaster um die Rolle des SWI/SNF Komplexes bei der Progression der Stammzellnachkommenschaft zu einer immer limitierteren Faehigkeit zur Selbsterhaltung zu untersuchen. Der Knockdown einiger Untereinheiten des SWI/SNF Komplexes (osa, brahma, moira und snr1) in einem speziellen Subtypen von Neuroblasten, Typ II Neuroblasten, und deren Nachkommen resultiert in einer Expansion von Neuroblasten-aehnlichen Zellen. Diese Zellen koennen entnommen werden, und wenn in gesunde Fliegen injiziert, proliferieren weiter und haben die Ausbildung von transplantierbaren Tumoren zur Folge. Eine detaillierte Analyse des osa Knockdown Phaenotyps ergab, dass dies auf eine Reversion von TA-Zellen zurueck zu Neuroblasten, also Zellen mit unlimitiertem Selbsterhaltungspotential, zurueck zu fuehren ist. Dies deutet darauf hin, dass Osa die Entstehung von Tumoren verhindert, indem es die korrekte unidirektionale Progression der Stammzellnachkommen zu einer immer staerker differenzierten Indentitaet sicher stellt. Wir zeigen in dieser Arbeit, dass Osa erst nach der asymmetrischen Teilung des Neuroblasten in den TA-Zellen ein Programm ausloest, welches deren Faehigkeit zur Selbsterhaltung, und damit die Anzahlt der Zellzyklen die durchlaufen werden koennen, limitiert. Wir haben das Prdm Protein Hamlet (Ham) identifiziert, welches hauptverantwortlich fuer die Initiierung dieses Programms ist. In Neuroblasten ist Ham nicht exprimiert, waehrend seine Expression in TA-Zellen direkt durch Osa aktiviert wird. Ham ist sowohl notwendig als auch ausreichend um die Anzahl an Zellteilungen bei denen eine Tochterzelle ihre Indentitaet beibeihaelt und sich weiterhin teilen kann, zu limitieren. Eine Ueberexpression von ham in Neuroblasten resultiert in deren verfruehter Differenzierung und damit einem Unterproliferationsphaenotyp. Auf der anderen Seite bedeutet ein Verlust des Ham Proteins in Typ II Neuroblasten und deren Nachkommen eine Akkumulierung von ektopischen Vorlaeuferzellen. Wir zeigen, dass Ham fuer die Etablierung der korrekten zeitlich bedingte Identitaet von Vorlaeuferzellen notwendig ist, und dass die Abwesenheit von Ham den Wechsel von mittelalten zu alten Vorlauefern blockiert. Dies resultiert in einer Verlaengerung ihrer Lebensdauer und damit zu mehr Zellteilungen. Da Prdm Proteine zur Familie der Histonmethyltransferasen mit einer SET Domaene gehoeren, waere es interessant zu untersuchen ob Ham die Progression der zeitlichen Vorlaeuferzellidentitaet vermittelt, indem es auf epigenetischer Ebene die Expression der temporalen Transkriptionsfaktoren modifiziert. Um dieses Experiment Zelltypspezifisch durchfuehren zu koennen, beschreiben wir im letzten Kapitel dieser Arbeit ein Protokoll mit dem von einer limitierten Anzahl an Zellen, die durch FACS gewonnen werden, Chromatin Immunopraezipitationen fuer Histonmarkierungen, gefolgt von deren Sequenzierung, durchgefuehrt werden koennen. Zusammengefasst bieten unsere Daten eine mechanistische Erklaerung fuer die weitverbreitete Tumorsuppressoraktivitaet des SWI/SNF Komplexes. Da auch die Ham Homologe Evi1 und Prdm16 haeufig in humanen Krebsen mutiert sind, ist es moeglich dass der von uns beschriebene Mechanismus auch in humanen Stammzellen und deren Nachkommen konserviert ist.

Abstract

(Englisch)

Stem cell lineages often contain a transit amplifying (TA) progenitor pool that multiplies the number of differentiating progeny. Unlike in stem cells, the ability to self-renew has to be limited in TA-progenitors to prevent uncontrolled proliferation. Understanding the mechanisms that control the progression from unlimited to limited self-renewal and ultimately to differentiation is therefore important for the treatment of stem cell originated tumors. Members of the SWI/SNF chromatin-remodeling complex are among the most frequently mutated genes in human cancer but how they suppress tumorigenesis is currently unclear. Here, we use Drosophila neural stem cells, called neuroblasts (NBs) to investigate the role of SWI/SNF complex in lineage progression and tumor formation. Knockdown of SWI/SNF complex subunits osa, brahma, moira and snr1 in type II NB lineages results in formation of ectopic NB-like cells that cause transplantable tumors. Detailed analysis of osa mutant clones demonstrate that this is due to dedifferentiation of progenitors, indicating that Osa prevents tumorigenesis in stem cell lineages by ensuring correct lineage progression. We show that Osa acts after asymmetric stem cell division to initiate a progenitor program limiting self-renewal in the TA-population. We identify the Prdm protein Hamlet (Ham) as a key component of this program. Ham is directly activated by Osa in progenitors and limits the number of asymmetric divisions in Drosophila NB lineages. Ham overexpression in NBs causes premature differentiation and underproliferation. Conversely, loss of ham function in type II lineages results in formation of ectopic progenitors. We show that Ham is required for correct temporal patterning of progenitors and loss of Ham function blocks the transition from middle-aged to old progenitors, extending their life span. As Prdm family proteins belong to SET domain family of histone methyltransferases it will be interesting to investigate whether Ham mediates the progression of temporal patterning via epigenetic modifications at the temporal transcription factor loci. In the final chapter of this thesis a protocol for performing histone mark chromatin immunoprecipitation followed by sequencing from limited number of FACS sorted cells is described to test this hypothesis. As composition of SWI/SNF complex is relevant to its tissue specific functions, we performed affinity purifications followed by mass spectrometry to define the complex composition in Drosophila larval brain. We identified potential novel binding partners of the complex. Future studies will determine the function of these binding partners. Collectively, our data provide a mechanistic explanation for the widespread tumor suppressor activity of SWI/SNF. As the Ham homologs Evi1 and Prdm16 are frequently mutated in cancer, this mechanism could well be conserved in human stem cell lineages.

Autor*innen

Elif Eroglu

Haupttitel (Englisch)

The SWI/SNF complex regulates the Prdm protein Hamlet to ensure lineage directionality in Drosophila neural stem cells

Paralleltitel (Deutsch)

Der SWI/SNF Komplex reguliert das Prdm Protein Hamlet, um sicherzustellen, dass sich die Nachkommenschaft von neuronalen Stammzellen aus Drosophila korrekt entwickelt

Publikationsjahr

2014

Umfangsangabe

188 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Ben-Zion Shilo ,

Thomas Hummel

Klassifikationen

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,

42 Biologie > 42.15 Zellbiologie

AC Nummer

AC11430759

Utheses ID

28283

Studienkennzahl

UA | 094 | 490 | |

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