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High density lipoprotein isolation and characterization to obtain high purity HDL samples for immunological assays
Georg Michlits
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Betreuer*in
Pavel Kovarik
DOI
10.25365/thesis.32010
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29462.20169.624364-5
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Seit der Erkenntnis, dass niedrige Blutwerte an HDL-C (high density lipoprotein-cholesterol) ein erhöhtes Risiko für kardiovaskuläre Erkrankungen darstellen, ist HDL in den Fokus der Forschung gerückt. HDL spielt nicht nur eine zentrale Rolle im RCT (reverse cholesterol transport), also dem Transport von Cholesterol von peripherem Gewebe zur Leber und in weiterer Folge zur Ausscheidung über die Galle, sondern beeinflusst auch das Immunsystem. Es wurde gezeigt, dass HDL anti-inflammatorische Eigenschaften hat und zum Beispiel die Expression von Interleukinen und Oberflächenrezeptoren in verschiedenen Immunzellen inhibieren kann. Das zentrale Ziel der HDL-Forschung ist nun die Aufklärung verschiedener funktioneller Mechanismen um ein besseres Verständnis der immunologischen Eigenschaften von HDL zu erlangen.
Um den Einfluss von Zusammensetzung und Reinheit isolierter HDL-Proben auf immunologische Experimente zu untersuchen analysierten wir HDL-Proben aus vier Laboratorien in Österreich mittels Ausschlusschromatographie. Wir fanden dabei Anteile an LDL in drei und hohe Anteile an Albumin in allen vier Proben. Keine der uns bereitgestellten Proben hatte einen höheren Anteil als 67% HDL. Um die Qualität der HDL Proben zu verbessern, führten wir eine schrittweise Optimierung der Isolationsprotokolle durch. Desweitern verglichen wir zwei parallel durchgeführte Isolationsmethoden (Gradientenultrazentrifugation und sequentielle Ultrazentrifugation) kombiniert mit zwei ebenfalls parallel durchgeführten Entsalzungsmethoden (Dialyse und Entsalzung mittels Polydextransäulen).
Wir entwickelten ein Protokoll zur Isolation von HDL mittels Gradientenultrazentrifugation und Entsalzung mit Polydextransäulen und erreichten damit einen HDL-Anteil von 98% mit nur etwa 2% Albumin. Mit diesen Proben zeigten wir die konzentrationsabhängige Inhibierung der Interleukinexpression von Monozyten und demonstrierten die Einschränkung der anti-inflammatorischen Wirkung von HDL-Proben mit weniger als 93% und weniger als 83% Reinheit.
Diese Arbeit soll unterstreichen wie wichtig die Reinheit von HDL-Proben für funktionelle Analysen ist. Auch soll sie als Anleitung zur Optimierung von HDL Isolationsmethoden dienen. Eine wichtige Erkenntnis ist auch, dass Ausschlusschromatographie als wichtiges Instrument zur Qualitätsüberprüfung von HDL-Proben herangezogen werden kann und auch routinemäßig eingesetzt werden sollte.
Abstract
(Englisch)
High density lipoprotein (HDL) has been the focus of intense research since a correlation between low blood levels of HDL-cholesterol and decreased incidence of cardiovascular disease was found. HDL has been shown to be the major player in reverse cholesterol transport, which is transport of cholesterol from peripheral tissues to the liver where it is then secreted in the bile. HDL has also the ability to inhibit the inflammatory response of immune cells by inhibiting cytokine expression and expression of surface receptors. This has attracted the interest of immunologists and the functional assessment of HDL became the prime goal for HDL research.
To assess the impact of composition and purity of HDL samples on immunological experiments we analysed HDL samples from four different laboratories in Austria using liquid chromatography. In three samples we found LDL impurities, and in all four of them high levels of albumin impurities. HDL content was not higher than 67% in any of those samples. In order to optimise HDL sample quality we used a strategic approach optimising and comparing two isolation techniques (gradient ultracentrifugation and sequential ultracentrifugation) in combination with two desalting techniques (dialysis and polydextran desalting columns).
We developed a protocol using gradient ultracentrifugation and polydextran desalting columns that led to the isolation of HDL samples of 98% purity. Consequently, we demonstrated the importance of HDL sample purity for immunological experiments by showing concentration-dependent inhibition of interleukin expression in monocytes and reduced anti-inflammatory properties of samples of less than 93% and less than 83% purity.
This thesis should highlight the importance of HDL purity, be a guide on how to optimise HDL isolation procedures and be a reminder that size exclusion chromatography is a valuable tool to assess HDL sample quality and that it should be applied routinely.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
HDL high density lipoprotein
Schlagwörter
(Deutsch)
HDL high density lipoprotein
Autor*innen
Georg Michlits
Haupttitel (Englisch)
High density lipoprotein isolation and characterization to obtain high purity HDL samples for immunological assays
Paralleltitel (Deutsch)
Isolierung und Charakterisierung von high density lipoprotein für immunologische Versuche
Paralleltitel (Englisch)
High density lipoprotein isolation and characterization to obtain high purity HDL samples for immunological assays
Publikationsjahr
2014
Umfangsangabe
XII, 43, 24 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Pavel Kovarik
AC Nummer
AC12035787
Utheses ID
28460
Studienkennzahl
UA | 066 | 863 | |