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Nuclear import by an ADAR1 double stranded RNA binding domain
Silpi Banerjee
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Michael F. Jantsch
DOI
10.25365/thesis.32162
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29361.55627.424869-7
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
RNA-spezifische Adenosin-Deaminasen (ADARs) beeinflussen die Stabilität, Struktur und Lokalisation von RNAs durch RNA-Editierung. Säuger-ADAR1 ist ein nukleo-cytoplsmatisch shuttelndes Protein, welches drei doppelstrang-RNA Bindungsdomänen (dsRBDs) beinhaltet. Die dritte dsRBD in ADAR1 ist die erste Domäne dieses Typs, welche Kernlokalisation mediiert. In früheren Studien konnten wir zeigen, dass Kernimport durch Transportin 1 (Trn1) vermittelt wird und durch RNA-Bindung inhibiert wird. Die strukturellen Eigenschaften dieser Domäne waren jedoch unbekannt.
In dieser Doktorarbeit wurde im Rahmen einer Kollaboration die Struktur dieser Domäne mittels NMR ermittelt. Die Struktur zeigt eine dsRBD Faltung mit einer zusätzlichen alpha-Helix am Aminoterminus sowie weitere unstrukturierte Elemente an beiden Enden der Domäne. In vitro Mutagenese zeigt, dass die zwei flankierenden Regionen ein bimodulares Kernlokalisationssignal bilden. Die aminoterminale alpha Helix verändert dabei die relative Lage des N- und C-Terminus der dsRBD und bringt beide Enden nahe zueinander. Ich konnte ein neues bimodulares NLS erzeugen, indem ich die ADAR1-dsRBD3 durch eine andere dsRBD oder ein kurzes Peptid ersetzte, wobei die Lage der N- und C-terminalen Segmente unverändert blieb.
Dies zeigt, dass die dsRBD nicht für die Trn1 Interaktion benötigt wird, sondern lediglich die Position der zwei NLS-Module zueinander gewährleistet. Diese Beobachtung wird durch in-vitro Import - und Kopräzipitationsversuche verifiziert. Es werden also die zwei flexiblen Fragmente welche die ADAR1-dsRBD bestimmen an einer Seite der Domäne exponiert. Diese werden von Trn1 über die gleichen Kontaktpunkte gebunden, wie andere Trn1 Substrate. In der Gegenwart von doppelstrang RNA ist die Interaktion mit Trn1 inhibiert. Modelle zeigen, dass die dsRBD in Gegenwart von RNA vermutlich nicht in die Bindungstasche von Trn1 eindringen kann.
Abstract
(Englisch)
Adenosine deaminases that act on RNAs (ADAR) influence the stability, structure and localization of RNA molecules by RNA editing. Mammalian ADAR1 is a nucleo-cytoplasmic shuttling protein containing three double stranded RNA binding domains (dsRBDs). The third dsRBD is the first domain of this type which shows nuclear localization signal (NLS) activity. We could show previously that nuclear import is mediated by Transportin 1 (Trn1) and is inhibited by RNA-binding. However, the specific structural features allowing this dsRBD to act as a NLS were unknown.
In this PhD thesis in a collaborative effort the solution structure of this domain, ADAR1-dsRBD3 was determined. The structure revealed that ADAR1-dsRBD3 has an additional α-helix at its amino terminus and flanking regions on either side of the domain. In vitro mutagenesis analysis demonstrated that the two flanking regions constitute a bimodular nuclear localization signal. Importantly, the additional N-terminal α-helix radically changes the relative position of the N- and C-termini of the dsRBD thereby bringing the N-terminus in proximity to the C-terminus. Furthermore I could design new bimodular NLSs by replacing ADAR1-dsRBD3 by another unrelated dsRBD or even by a small peptide linker maintaining the positioning of the N-and C-terminal regions. This indicates that the dsRBD itself is not required for Trn1 interaction, but only helps to juxtapose the two NLS-modules that are distantly spaced in the primary structure. These observations were verified by both in-vitro import assay and pull down assays. Consequently, the two flexible fragments flanking ADAR1-dsRBD3 that constitute the active NLS are exposed on one surface and can be recognized by the same surface of Trn1 as is known for other Trn1 substrates. In the presence of double stranded RNA, Trn-1 interaction is disturbed. Modeling suggests that RNA-binding prevents the dsRBD-NLS to enter the Trn-1 pouch in its RNA-bound state.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Transportin 1 Karyopherin-β2 nuclear localization signal nucleocytoplasmic transport PY-NLS nuclear import NLS RNA-binding RNA-editing ADA dsRBD NMR
Schlagwörter
(Deutsch)
Transportin 1 Karyopherin-β2 Kernlokalisationssignal nukleozytoplasmatischen Verkehr PY-NLS Kernimport NLS RNA-bindende RNA-Editing ADAR dsRBD NMR
Autor*innen
Silpi Banerjee
Haupttitel (Englisch)
Nuclear import by an ADAR1 double stranded RNA binding domain
Publikationsjahr
2014
Umfangsangabe
96 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Michael F. Jantsch
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC12033709
Utheses ID
28587
Studienkennzahl
UA | 094 | 490 | |