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Semisynthesis of human tau protein

Benedikt Weirich

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Chemie

Betreuer*in

Christian Becker

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DOI

10.25365/thesis.32461

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29151.04713.556569-5

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Alzheimer ist eine neurodegenerative und progressive Krankheit, welche irreversible Schäden im Gehirn verursacht und multifaktoriell bedingt ist. Ein Protein, welches im Krankheitsverlauf eine Rolle spielt, ist das Tau-Protein. Im gesunden Gehirn dient es der Stabilisierung der Mikrotubuli. Die Regulierung der Affinität des Tau-Proteins muss durch verschiedene Faktoren geregelt werden. Neben sechs verschiedenen Isoformen, welche durch alternatives Spleißen gebildet werden, gibt es eine Vielfalt an Möglichkeiten für posttranslationale Modifikationen, welche die Affinität und andere Eigenschaften beeinflussen. Bei Alzheimer wird hyperphosphoryliertes Tau festgestellt, welches in den Neuronen aggregiert. Deshalb ist ein besseres Verständnis der posttranslationalen Modifikationen von Tau von großem Interesse. Jedoch gerade die Untersuchung von posttranslationale Modifikationen ist komplex und nicht jede Methode kann diese Modifikationen angemessen nachbilden. Broncel et al. wählten 2012 eine Proteinsemisynthese, mit der sie die Modifikationen im C-Terminalen Bereich untersuchten. Dieses Projekt erlaubt die gezielte Modifikation einzelner Aminosäuren im C-Terminalen Teil von Tau, welcher mittels Festphasenproteinsynthese produziert wurde. Diese Methodik wurde von der Gruppe unter Prof. Becker übernommen und auf die Modifikation eines mittleren Segmentes (Tau 291-321) übertragen. Hierzu wurde die längste Tau-Isoform in drei Segmente aufgeteilt. Das mittlere Segment wird mittels Proteinfestphasensynthese erzeugt. Die C- und N-terminalen Segmente (Tau 1-290 und Tau 322-441) werden in einer rekombinanten Expressionskultur produziert. Nach der Reinigung aller Segmente wird zuerst das C-terminale Segment mit dem mittleren Segment aus der Festphasensynthese mittels Nativer Chemischer Ligation (NCL) zusammengefügt. Nach der Entfernung des N-terminalen Schutzes des bereits ligierten Konstruktes wird dieses anschließend mit dem N-terminalen Segment verknüpft. Bislang wurde das C-terminale und das mittlere Segment von Christian Görner gereinigt und ligiert. Im Anschluss an diese Arbeit wurde in zuerst ein geeigneter Expressionsstamm für das N-Terminale Segment ermittelt. Aus dieser Quelle wurde das Segment gereinigt und erste Ligationsversuche durchgeführt. Dabei konnten ligationsfördernde Effekte von hohen Konzentrationen an Guanidinium HCl Puffer und Phosphatpuffern festgestellt werden. Die nächsten Schritte sind die vollständige Ligation aller Segmente und die Evaluation des vollständigen Konstruktes. Anschließend kann ein mittleres Segment mit definierten Modifikationen mittels Festphasensynthese hergestellt und ligiert werden.

Abstract

(Englisch)

Alzheimer is a multifactorial, neurodegenerative and progressive disease, which causes irreversible damage in the human brain. The Tau protein plays a role in this disease. It stabilizes microtubules in healthy human brain. Therefore the affinity towards microtubules needs to be regulated by various factors. Beside six different isoforms, which are assembled by alternative splicing, a huge amount of different sites for posttranslational modifications exists. All these possibilities alter affinity and properties of the Tau protein. In Alzheimer`s diseases brain the tau protein gets hyperphosphorylated and aggregates. For that reason a better understanding of the behavior of posttranslationally modified Tau is beneficial. But the research of posttranslationally modified proteins is complex and not all methods can reflect all effects of these modification appropriately. Broncel et al chose in 2012 a semisynthetic approach and modified the C-terminal part of Tau. This approach allows the targeted modification of single amino acids within the part, which is synthesized via SPPS. This approach was adopted by the group of Prof. Becker to establish the modification of a middle part (Tau 291-321) of the longest isoform. This implies the generation of three segments of human Tau 40. The middle segment was synthesized via SPPS. The C-terminal and the N-terminal segments (Tau 1-290 and Tau 322-441) are gained from recombinant overexpression cultures. After purification of the segments, the middle segment from the SPPS is ligated with the C-terminal segment via native chemical ligation. After the removement of the N-terminal protection against ligation that construct is ligated with the N-terminal segment. Up to now the C-terminal and the middle segments were purified and ligated by Christian Görner. The first task of this thesis was the evaluation of five Tau 1-290 expressing strains, which were cloned previously by Christian Görner. The most suitable strain was used for the purification of the N-terminal Tau segment. Best purification was achieved with a weak anion exchange column after covalent capturing via chitin beads. Pure N-terminal Tau dimerises which can be dissolved with high concentrations of Urea in SDS PAGE. After that ligation tests were performed, in which positive effects of Guanidinium HCl and Phosphate Buffers could be observed. Further steps of this project imply the ligation of the Tau 291-441 construct with the N-terminal segment and the evaluation. After that a middle segment with defined modifications can be produced via SPPS and used for ligation.

Autor*innen

Benedikt Weirich

Haupttitel (Englisch)

Semisynthesis of human tau protein

Paralleltitel (Deutsch)

Semisynthese des humanen Tau Proteins

Paralleltitel (Englisch)

Semisynthesis of Human Tau Protein

Publikationsjahr

2014

Umfangsangabe

52 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Christian Becker

Klassifikationen

35 Chemie > 35.62 Aminosäuren, Peptide, Eiweiße ,

35 Chemie > 35.70 Biochemie: Allgemeines

AC Nummer

AC12049593

Utheses ID

28827

Studienkennzahl

UA | 066 | 863 | |

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Schlagwörter