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Mehrfach 2'-PEGylierte Oligonukleotide für effizientes Gensilencing
Barbara Pöhacker
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Ernst Urban
DOI
10.25365/thesis.32937
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29980.57346.980753-3
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Kurze RNA und DNA Oligonukleotide können über Watson-Crick-Basenpaarungen mit einer Ziel-RNA interagieren und somit selektiv die Genexpression beeinflussen. Diese Eigenschaft macht unterschiedliche Oligonukleotide, wie Antisense Oligonukleotide, siRNAs und SSO, vor allem für die Therapie von genetischen und viralen Erkrankungen, sowie Krebs interessant.
Es befinden sich bereits einige Vertreter am Markt und in klinischer Testung, der große Durchbruch blieb aber noch aus. Dies liegt an der beschränkten Anwendungsmöglichkeit der Oligonukleotid Therapeutika. Große Hindernisse stellen der Abbau durch Enzyme, die kurze Halbwertszeit, die hohe renale Clearance, unspezifische Bindungen und der unzureichende Transport zur und in die Zelle dar. Um die pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Eigenschaften der Oligonukleotide zu verbessern, werden unterschiedliche chemische Modifikationen, Konjugate und Transportvehikel entwickelt.
Im Laufe dieser Diplomarbeit wurde eine Konjugation von Oligonukleotiden mit Polyethylenglykol-Ketten durchgeführt. Eine solche PEGylierung führt gewöhnlich zu einer höheren Stabilität und Bioverfügbarkeit, während die Toxizität und immunologische Effekte abnehmen.
Ein Schwerpunkt war es, einen modifizierten Adenosin-Baustein zu synthetisieren, der anschließend mittels Festphasensynthese in ein Oligonukleotid eingebaut werden konnte. Dazu wurde zunächst ein Phosphoramidit-Nukleotid mit entsprechenden Schutzgruppen an den 3‘- und 5‘-Positionen hergestellt, das zur späteren PEGylierung einen Aminohexyl-Linker in 2‘-Position des Zuckers besaß.
Die Reaktions- und Aufreinigungsschritte wurden mittels Dünnschichtchromatographie kontrolliert und die Strukturaufklärung der Produkte erfolgte mittels 1H-NMR und 13C-NMR Spektroskopie.
Ein weiterer Schwerpunkt der Diplomarbeit lag bei der Herstellung der PEG-Konjugate. Die Oligonukleotide mit den modifizierten Nukleosiden wurden mittels optimierter Methode abgespalten, entschützt und aufgereinigt und anschließend erfolgreich mit NHS-aktivierten PEG-Ketten gekoppelt. Die Reaktionsverläufe und Aufreinigungsschritte wurden mittels HPLC und Gelelektrophorese kontrolliert. Zuletzt wurden die aufgereinigten Oligonukleotide und ihre Konjugate mittels ESI-MS analysiert.
Abstract
(Englisch)
Short RNA or DNA oligonucleotides are able to interact with RNA-targets with high selectivity by engaging in Watson-Crick base pairing. As a result, they are able to manipulate gene expression. Because of their properties, oligonucleotides like antisense oligonucleotides, siRNA’s and splice switching oligonucleotides, have tremendous potential in the treatment of various diseases like genetic disorders, viral infections and cancer.
Although there are some oligonucleotides approved and more in clinical testing, the great breakthrough hasn’t been achieved yet. This is because of the limited opportunities for application of oligonucleotides. There are some important hurdles like degradation through enzymes, short half-life, high renal clearance, off-target effects and insufficient delivery of the oligonucleotides. To improve pharmacokinetic and pharmacodynamic properties, chemical modifications and conjugates or vesicles for delivery have been developed.
Conjugates of oligonucleotides with PEG-chains were produced during this diploma thesis. PEGylation is a viable way to improve stability and bioavailability whereas toxicity and immunologic processes are decreased.
The main aim was the synthesis of a modified adenosine, which would later be introduced in an oligonucleotide during solid phase synthesis.
Therefore it was necessary to synthesize a phosphoramidite-molecule with appropriate protection groups at the 3’- and 5’-position. For the planned PEGylation there was a linkage in 2’-position of the nucleotide sugar. Reactions and purification steps were controlled with DC and products were analyzed with 1H-NMR and 13C-NMR spectroscopy.
The preparation of PEG-conjugates was another point of main effort.
First, methods for cleavage, deprotection and purification of the oligonucleotides had to be optimized. Then the oligonucleotides were conjugated with NHS-activated PEG-chains. Reactions and purification steps were controlled with HPLC and gel electrophoresis. In the end the oligonucleotides and their conjugates were analyzed with ESI-MS.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Oligonukleotide PEGylierung siRNA SSO 2'-Modifikation PEG modifiziertes Adenosin
Autor*innen
Barbara Pöhacker
Haupttitel (Deutsch)
Mehrfach 2'-PEGylierte Oligonukleotide für effizientes Gensilencing
Publikationsjahr
2014
Umfangsangabe
59 S. : Ill., graf. Darst.
Sprache
Deutsch
Beurteiler*in
Ernst Urban
AC Nummer
AC11711660
Utheses ID
29257
Studienkennzahl
UA | 449 | | |