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Human alpha satellite-derived transcripts interact with RNA polymerase II

Katarzyna Matylla

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Renée Schroeder

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DOI

10.25365/thesis.32947

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29274.39800.389670-3

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Es ist nach wie vor eine offene Frage ob repetitive Regionen des humanen Genoms eine Funktion haben. Diese Frage stellt sich nach zwei kürzlich beobachteten Fakten: 60 bis 70 % der humanen DNA wird in RNA überschrieben und die Hälfte des humanen Genoms ist repetitiv oder stammt von repetitiven Elementen ab. Humane α Satelliten sind 171 bp lange Einheiten, die sich in Tandem Kopf-Schwanz Anordnung zu langen Reihen ordnen und dabei mehrere Hunderttausend bis Millionen Basen umfassen. Man findet sie vor allem in der Nähe von Zentromeren auf jedem humanen Chromosom. Diese α Satelliten garantieren die korrekte Segregation der Chromosomen weil sie der Ort der Spindelanhaftung darstellen. Hier zeigen wir, dass α Satelliten von beiden DNA Strängen in lange Transkripte (über 8 kb) überschrieben werden. Ihre Expression ist stärker unter Stressbedingungen and auf die S Phase des Zellzyklus beschränkt. Die Transkritption der α Satelliten ist α Amanitin sensitiv, was auf RNA polymerase II Transkritpe hinweist. Ihre 5’ Enden weisen eine typische Cap-struktur auf. Anders als viele RNA polymerase II Transkripte sind sie nicht polyadenyliert und sie bleiben im Zellkern lokalisiert. Um einer Funktion dieser Transkripte näher zu kommen, haben wir Proteine als Bindungspartner gesucht. In einem genomischen SELEX Experiment mit RNA polymerase II als Köder haben wir mehrere RNA Aptamere aus α Satelliten erhalten. Weiterhin haben wir gefunden, dass RNAs aus α Satelliten mit dem aktiven Zentrum von RNA polymerase II interagieren und zu einer DRB (5,6-dichloro-1-beta-D-ribofuranosylbenzimidazole) sensitiven Markierung des 3’ Endes und/oder einer Synthese des zweiten Stranges führen. Das suggeriert, dass die RNA polymerase II eine RNA-abhängige RNA Polymeraseaktivität (RdRP) an endogenen Substraten ausführen kann. Diese Aktivität haben in vivo mit HeLa Zellen und einer Nukleofektion mit chimeren Transkripten, welche α Satelliten RNA und artifiziellen Sequenzen beinhalten gezeigt. Dieses Experiment zeigt die RdRP Aktivität mit genomischer RNA als Templat. Diese Beobachtungen schlagen vor, dass RNAs aus α Satelliten in Transkriptionsregulation involviert sein können. Während phylogenetischer Studien um die Sekundärstruktur von α Satelliten und deren Konservierung zu analysieren, haben wir entdeckt, dass αsatRNAs nicht nur die Hairpin–Angel-Hairpin Struktur aufweisen, sondern auch die H/ACA Motive, die typisch für snoRNAs sind, beinhalten. Wir haben daher die Hypothese aufgestellt, dass αsatRNAs höchstwahrscheinlich von snoRNAs abstammen und durch Retroptranposons mobilisiert wurden.

Abstract

(Englisch)

Whether repetitive regions of the human genome have a function is a very intriguing question. At least 50 % of the human genome is repetitive and following the ENCODE consortium report, up to 60-70 % of the genome is transcribed. As a consequence, the human transcriptome contains a significant fraction of repeat-derived transcripts. Human α satellites consist of 171 bp monomers arranged tandemly in a head-to-tail manner, organized into arrays of higher order repeats spanning hundreds of kilobases to megabases. They predominantly localize near centromeres on every human chromosome, where they assure proper chromosome segregation as a site for the spindle attachment. Here, we demonstrate that α satellite arrays are transcribed from both DNA strands into long non-coding αsatRNAs (more than 8 kb). Their expression is more pronounced under cellular stress conditions and peak during the S phase of the cell cycle. We observe that the transcription rate of αsatRNAs might be down-regulated to the typical levels only one hour after stress release. Transcription of α satellites is sensitive to α amanitin treatment, indicating that they are RNA polymerase II transcripts. Examination of the 5’ termini of αsatRNAs reveals that they possess a cap structure. However, unlike most RNA polymerase II transcripts, they are not polyadenylated and are retained in the nucleus. In order to grasp a putative αsatRNAs function, we searched for a protein interacting partner. In genomic SELEX using RNA polymerase II as bait, we had isolated several aptamers derived from α satellite repeats, suggesting that αsatRNAs interact with RNA polymerase II. Moreover, we found that αsatRNAs bind RNA polymerase II in the active site, serving as substrates for its activities. Using HeLa cells nucleofection with chimeric templates combining α satellite aptamer with an artificial 15-mer, we show that the α satellite RNA is a substrate for RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) activity in vivo. In addition, we detected 5,6-dichloro-1-beta-D-ribofuranosyl-benzimidazole (DRB)-sensitive 3’ extension of the αsatRNAs in vitro. Both activities are held by RNA polymerase II. As yet, we do not provide evidence that the products of these reactions are functional. However, we envision that the αsatRNAs-RNA polymerase II interaction may control the transcriptional rate of functional centromeres. Upon studying the phylogeny and analyzing the secondary structure of α satellites and alphoid sequence from other primates, we realized that αsatRNAs not only fold into the hairpin-hinge-hairpin structure, similarly to snoRNAs, but also contain H/ACA boxes. Therefore, we propose that αsatRNAs are likely descendents of snoRNA mobilized by transposable elements.

Autor*innen

Katarzyna Matylla

Haupttitel (Englisch)

Human alpha satellite-derived transcripts interact with RNA polymerase II

Paralleltitel (Deutsch)

Charakterisierung von humanen alpha-Satelliten Transkripte

Publikationsjahr

2014

Umfangsangabe

208 S.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Christina Waldsich ,

Claire Vourc'h

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC12098174

Utheses ID

29267

Studienkennzahl

UA | 091 | 490 | |

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