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Novel molecular tools for microbial ecology

development and application to decipher trophic structures of nitrifying communities

Jan Dolinšek

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Michael Wagner

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DOI

10.25365/thesis.33005

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29658.34438.502670-2

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Eine Hauptaufgabe von modernen Kläranlagen besteht in der Entfernung von Stickstoffverbindungen. Ein wichtiger Schritt der Stickstoffentfernung ist die Nitrifikation, die Oxidation von Ammoniak zu Nitrat und weiter zu Nitrit. Diese wird von verschiedenen chemolithoautotrophen Bakterien katalysiert, die mit der daraus gewonnenen Energie Kohlenstoff fixieren und in ihre Biomasse einbauen. Derzeit gibt es wenige Untersuchungen zu heterotrophen Organismen, die direkt von der Nitrifikation abhängig sind, obwohl diese eine wichtige Rolle in der Ökologie von Nitrifizierern spielen könnten. Für die Identifizierung von jenen Organismen, die über eine Nahrungskette mit Nitrifizierern verbunden sind, wurde Belebtschlamm einer Kläranlage untersucht. RNA stable isotope probing wurde mit einem in dieser Studie entwickelten LNAzym-Verdau von rRNA sowie T-RFLP Analyse und 16S rRNA Sequenzierung kombiniert. Die 13C markierte rRNA kodiert neben den bekannten Nitrifizierern auch das obilgat räuberische Bakterium Micavibrio aeruginosavorus. Weiters wurde der Belebtschlamm mittels Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) analysiert und mit 3D Kolokalisierungs-Analysen genauer betrachtet. Die Untersuchungen bestätigten, dass lineage I Nitrospira eng und spezifisch mit einem Micavibrio-ähnlichem Alphaproteobakterium zusammen lebt, und ergaben, dass jenes Alphaproteobakterium als obligater Räuber lebt. Weiters wurde, wieder mit Hilfe von rRNA Verdau mittels LNAzymen, eine Analyse einer Langzeit-Anreicherung von Ca. Nitrospira defluvii durchgeführt, die auch aus einer diversen, heterotrophen und von Nitrifikation abhängigen mikrobiellen Gemeinschaft bestand. Die Ergebnisse lieferten neue Einblicke in die Ökologie von Nitrit oxidierenden Bakterien und ihren assoziierten Mikroben und darüber, wie Gemeinschaften von Nitrospira beeinflusst werden können. Um zukünftige Analysen mit NanoSIMS zu unterstützen, wurden zwei weit verbreitete Methoden in der Analyse von mikrobiellen Gemeinschaften, FISH und CARD-FISH (Catalyzed Reporter Deposition FISH) modifiziert, indem sie mit der sogenannten Click-Chemie kombiniert wurden. Die dadurch gewonnene zusätzliche Flexibilität von Click CARD-FISH wurde gezeigt, indem spezifisch und simultan Zellen einer künstlichen Gemeinschaft mit Deuterium und Fluor markiert wurden, welche nützliche Marker in NanoSIMS Studien darstellen. Ausserdem verspricht das Markieren von Zellen mit Deuterium universale Anwendbarkeit und umgeht die Nachteile, die beim phylogenetischen Labeling mit CARD-FISH präsent sind.

Abstract

(Englisch)

Efficient nitrogen removal is one of the central processes in modern waste-water treatment plants (WWTPs). It relies heavily on the oxidation of ammonia to nitrite and further to nitrate, catalyzed by diverse chemolithoautotrophic bacteria that harness the released energy to fix CO2 and for concomitant growth. Although it might play an important part in ecology of nitrifying microbes, nitrifier-dependent heterotrophy is arguably among the least researched of all chemolithoautotrophically fuelled food-webs. To identify organisms that receive fixed carbon from nitrifiers in WWTPs, RNA stable isotope probing was combined with newly developed LNAzymes digestion of target rRNA molecules, T-RFLP analysis, and 16S rRNA sequencing. In addition to known nitrifiers, 13C labeled rRNA was affiliated with obligatory predatory bacterium Micavibrio aeruginosavorus. Further activated sludge examination with fluorescence in situ hybridization (FISH) and 3D colocalization analysis confirmed the specific and close cohabitation of lineage I Nitrospira with the Micavibrio-related alphaproteobacterium, most likely an obligatory predatory bacterium. LNAzymes-mediated digestion of rRNA was employed to analyze a long-term enrichment of Ca. Nitrospira defluvii containing a diverse nitrification-dependent heterotrophic community. These results provide new insights into the ecology of nitrite oxidizing bacteria and associated bacteria and extend our notion of factors that can control Nitrospira populations. To assist future stable isotope studies, two widely used methods for microbial community analysis, FISH and CARD-FISH (Catalyzed Reporter Deposition FISH) were modified and made compatible with click-chemistry labeling. The additional labeling flexibility of Click CARD-FISH was demonstrated by specifically and simultaneously labeling cells in an artificial community with deuterium and fluorine, which are useful identity markers in NanoSIMS studies. Furthermore, the newly introduced phylogenetic labeling of cells with deuterium holds high promise for its universal applicability and possibility of correcting biases inherent to phylogenetic staining by CARD-FISH.

Autor*innen

Jan Dolinšek

Haupttitel (Englisch)

Novel molecular tools for microbial ecology

Hauptuntertitel (Englisch)

development and application to decipher trophic structures of nitrifying communities

Paralleltitel (Deutsch)

Anwendung neuer molekularer Methoden in der Mikrobiellen Ökologie ; Bespiele aus nitrifizierenden Lebensgemeinschaften

Paralleltitel (Englisch)

Novel Molecular Tools for Microbial Ecology: Development and Application to Decipher Trophic Structures of Nitrifying Communities

Publikationsjahr

2014

Umfangsangabe

181 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Martin Wagner ,

Edouard Jurkevitch

Klassifikationen

42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie ,

42 Biologie > 42.90 Ökologie: Allgemeines

AC Nummer

AC12057337

Utheses ID

29319

Studienkennzahl

UA | 091 | 444 | |

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