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Darstellung und Charakterisierung von PEI-modifizierten Mikropartikeln und deren Interaktion mit gesundem und entzündetem Endothel

Alexandra Schlögl

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Franz Gabor

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DOI

10.25365/thesis.33074

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29127.83041.235769-0

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Für eine zielgerichtete Therapie werden häufig partikuläre Trägersysteme eingesetzt, die den inkorporierten Arzneistoff ins erkrankte Gewebe transportieren sollen. Um den Einfluss der Ladung dieser Partikeln auf die Interaktion mit Zellen untersuchen zu können, wurden durch Adsorption von niedermolekularem Polyethylenimin (PEI) positive Ladungen an der carboxylierten Oberfläche von Polystyrolpartikeln mit einem Durchmesser von 1 µm eingeführt. Nach einigen Optimierungsschritten konnten stark positive geladene und damit lagerungsstabile Partikel hergestellt werden. Nicht nur an Hand des pH-abhängigen Zetapotentiales, sondern auch durch Quantifizierung der Menge an ungebundenem, überschüssigem PEI mittels eines entsprechend adaptierten Bradford-Assays konnte die Oberflächenmodifikation bestätigt werden. Die Bindungseffizienz der PEI-modifizierten Partikel wurde an Endothelzellmonolayern als in-vitro Modell für Blutgefäße untersucht, wobei die Bindungsrate von PEI-modifizierten Partikeln im Vergleich zu den negativ geladenen, unbehandelten Partikeln leicht erhöht war. Im Vergleich zu gesunden Endothelzellen wurde keine Änderung in der Bindungsaffinität zu entzündeten Endothelzellen beobachtet und damit ist Ladung allein als target-Prinzip für entzündetes Gewebe nicht ausreichend. Um bessere Einblicke in die molekularen Unterschiede zwischen gesundem und entzündetem Endothel zu erhalten, wurde ein in-vitro Modell für entzündetes Gewebe entwickelt. E-Selektin wird von Endothelzellen nicht konstitutiv exprimiert, sondern erst nach Kontakt der Zelle mit inflammatorischen Stimuli und stellt daher nicht nur einen Entzündungsmarker, sondern auch eine mögliche Zielstruktur für die Therapie von entzündlichen Krankheiten dar. Durch Stimulation mit TNF-α konnte an primären (HUVEC) sowie an immortalisierten Endothelzellen (HUVECtert) eine Entzündung induziert werden, die durch einen E-Selektin-spezifischen, Fluorescein-markierten Antikörper flowcytometrisch quantifiziert wurde. Dabei zeigte sich, dass die Entzündung bei HUVECtert prinzipiell schwächer ausfiel als bei Primärzellen. Darüber hinaus wurden die Internalisierung und der folgende lysosomale Abbau von E-Selektin mit Hilfe von Monensin nachgewiesen. So konnte nach der Zytokinstimulation neben der Expression auch die zeitliche Veränderung der E-Selektin-Dichte an der Zelloberfläche charakterisiert werden. Um eher physiologische Gegebenheiten zu simulieren und hohe Zellverluste zu vermeiden, wurden alle Untersuchungen nicht an Einzelzellen, sondern ausschließlich an Endothelzellmonolayern durchgeführt. Da die Analytik nur durch Durchflusszytometrie möglich war, diese jedoch an Einzelzellen gebunden ist, wurde zusätzlich ein Protokoll zur Gewinnung von Einzelzellsuspensionen entwickelt. Insgesamt konnte in dieser Arbeit aufbauend auf der Entwicklung von Versuchsprotokollen mit humanem artifiziellem Endothel einerseits E-Selektin als mögliche Zielstruktur für die selektive Therapie von Gefäßentzündungen weiter charakterisiert werden und andererseits positive Ladung als mögliches zusätzliches Targeting-Prinzip identifiziert werden.

Abstract

(Englisch)

Most frequently particular carrier systems are applied for targeted therapy which are aimed to shuttle the loaded drug into the diseased tissue. To investigate the influence of surface charge on the particle-cell interaction, the surface of carboxylated polystyrene particles with 1 µm in diameter was converted to a positive one by adsorption of low molecular weight polyethyleneimine (PEI). After optimization experiments strongly positive charged and storage-stable particles were obtained. The surface modification of the particles was not only confirmed by the pH-dependent zetapotential, but also by quantification of the amount of unbound PEI, which has been determined by a modified Bradford assay. For estimation of the binding efficiency of PEI-modified particles endothelial cell monolayers were used as an in-vitro model of blood vessels. The binding rate of PEI-modified particles was slightly higher than that of non-treated particles. Additionally, the binding efficiency of healthy and inflamed tissue was similar indicating that charge without any other altered parameter is insufficient for targeting inflamed tissue. For a deeper understanding of the molecular differences between healthy and inflamed endothelium, a human in-vitro model simulating inflamed tissue has been developed. E-selectin is not constitutively expressed by endothelial cells, but only after stimulation with inflammatory substances. Thus, E-selectin is not only a marker for inflammation but also a potential target for treatment of inflammatory diseases. Stimulation of cells with TNF-α caused inflammation of primary endothelial cells (HUVEC) as well as immortalized endothelial cells (HUVECtert), which has been quantified flow cytometrically by an E-selectin fluorescein-labeled antibody. These assays also revealed that the inflammation of HUVECtert was less developed than that of primary cells. Furthermore, the internalization and following lysosomal degradation has been demonstrated by use of monensin. After stimulating cells that way, not only expression but also the decreasing E-selectin density at the cell surface by time was observed. In order to approach physiological conditions and to avoid cell loss, all the studies were performed on confluent endothelial cell monolayers, that were cultivated in microplates. As flow cytometric analysis requires single cells, a protocol for dissociation of tissues was developed. All in all, positive surface charges of particles have been identified as an additional, but non-exclusive parameter for targeting of inflammation. Moreover, ongoing from the development of experimental protocols with human artificial endothelium the potential of E-selectin to act as a target for selective therapy of vascular inflammation was further characterized.

Autor*innen

Alexandra Schlögl

Haupttitel (Deutsch)

Darstellung und Charakterisierung von PEI-modifizierten Mikropartikeln und deren Interaktion mit gesundem und entzündetem Endothel

Publikationsjahr

2014

Umfangsangabe

73 S. : Ill., graf. Darst.

Sprache

Deutsch

Beurteiler*in

Franz Gabor

Klassifikation

44 Medizin > 44.40 Pharmazie, Pharmazeutika

AC Nummer

AC11723409

Utheses ID

29377

Studienkennzahl

UA | 449 | | |

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