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Spectral characterisation of different glycerol diphytanyl ethers as pure substances and part of the cell membrane of archaea using time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) and matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry (MALDI-MS)

Marcus Wieder

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Chemie

Betreuer*in

Michael Wagner

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DOI

10.25365/thesis.33088

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29448.40540.306455-6

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Glycerol-Diphytanyl-Diether und Glycerol-Diphytanyl-Glycerol-Tetraether (GDGT) sind Hauptbestandteile von archaealen Lipiden und könnten als Biomarker zur Einzelzelli- dentifizierung und -differenzierung von Archaea und Bakterien verwendet werden - eine Voraussetzung hierzu ist ein analytisches Instrument mit der benötigten räumlichen Auflösung sowie ausreichender Massenauflösung. Ein analytisches Instrument, welches dieses Anforderungsprofil erfüllt, ist das ToF (Time-of-Flight) - SIMS (Secondary Ion Mass Spectroscope). Glycerol-Diphytanyl-Diether und Glycerol-Diphytanyl-Glycerol- Tetraether wurden als Reinsubstanzen auf ihr Fragmentierungsverhalten mit MALDI (Matrix-unterstützte Laser- Desorption/Ionisation) -MS/MS und ToF-SIMS untersucht gefolgt von ToF-SIMS Messungen von Prokaryonten. Von primären Interesse war ein spezielles GDGT - Crenarchaeol - welches einzigartig für das Phylum Thaumarchaeota (chemolithoautotrophe Ammoniak oxidierende Archaea) ist. Das Ziel dieser Masterarbeit war die Identifizierung von Crenarchaeol-Ionen, -Addukten und -Fragmenten welche zur Identifizierung von Thaumarchaeota im Gemisch mit anderen Prokaryoten genutzt werden können. Methoden Analysiert wurden zwei Glycerol-Diphytanyl-Diether (1,2-Di-O-Phytanyl-sn-Glycerol und 1,2-Di-O-Phytanyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamin) und ein Glycerol-Diphytanyl-Glycerol- Tetraether (Crenarchaeol) unter Verwendung von ToF-SIMS und MALDI-MS. Spektren wurden mit Hilfe gängiger Molekülsignale [M]+, [M]-, Fragmenten und Addukten analysiert. Weiters wurden zwei Prokaryonten (Archaeon N. viennensis und Bakterium E. coli) mit ToF-SIMS analysiert. Die Spektren dieser Organismen wurden mit Hilfe von bekannten Biomarkern für Biomasse untersucht. Weiters wurden Methoden der multivarianten Statistik (PCA und Korrelationsanalysen) zur Auswertung angewendet. Auch wurde im Bioinformatik-Teil dieser Arbeit nach zwei noch nicht charakterisierten Enzymen im Biosynthesepfad von Crenarchaeol mit Hilfe von orthologen Genen, phylogenetischen und biochemischen Überlegungen gesucht. Resultate und Zusammenfassung MALDI-MS zeigte positive Molekülsignale für beide Glycerol-Diphytanyl-Diether, jedoch nicht für Crenarchaeol. ToF-SIMS konnte bei allen drei Reinsubstanzen positive Molekülsignale zeigen. Die folgende Analyse der Prokaryonten mit ToF-SIMS konnte Crenarchaeol in Archaea nicht nachweisen - jedoch wurde ein Fragment gefunden welches von Crenarchaeol stammen könnte. Die ToF-SIMS Analyse war häufig nicht in der Lage die Topologie der Zellen mit mittleren bis hohen Massen abzubilden. Weiters war es oft nicht möglich zwischen Bereichen mit Biomasse und Bereichen ohne Biomasse mit Hilfe der Spektren zu unterscheiden und die Intensität für Moleküle über 600 Dalton war sehr gering. Die Zerstörung der Oberfläche durch den primären Ionenstrahl war zu vollständig und der Ioneneinschlag fragmentierte die organischen Moleküle an und unter der Oberfläche. Die statistische Analyse ergab, dass es bei gemittelten und normierten Spektren möglich ist mittels PCA zwischen E. coli und N. viennensis zu unterschei- den. Die Loadings, welche hierfür verantwortlich waren, sind jedoch wahrscheinlicher ein Resultat unterschiedlicher Präparationsmethoden. Die Suche nach den zwei noch nicht charakterisierten Enzymen im Biosynthesepfad von Crenarchaeol ergab eine Liste von möglichen Kandidaten welche als Startpunkt für weitere biochemische Untersuchungen verwendet werden kann.

Abstract

(Englisch)

Glycerol diphytanyl diethers and glycerol diphytanyl glycerol tetraethers (GDGT) are major components of archaeal lipids and could be utilized as a biomarker to differentiate between archaea and bacteria given an instrument that is able to resolve mass spectra in the high mass range with high lateral resolution and mass accuracy. An instrument possessing such features is the ToF (Time-of-Flight) - SIMS (Secondary Ion Mass Spectroscope). Spectra of pure substances of Glycerol diphytanyl diethers and GDGTs were analyzed with MALDI-MS/MS and ToF-SIMS to find significant fragments for these lipids followed by ToF-SIMS measurements of prokaryotes to test the utility of these fragments in a real life application. One specific GDGT - crenarchaeol - is unique for the phylum thaumarcheaota (chemolithoautotrophic ammonia-oxidizers) and the aim of this thesis was to find crenarchaeol ions and fragments with sufficient intensity to identify thaumarchaeota in a mixture of different prokaryotes. Methods Spectra were obtained from two glycerol diphytanyl diethers (1,2-Di-O-Phytanyl-sn-Glycerol and 1,2-Di-O-Phytanyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine) and one glycerol diphytanyl glycerol tetraether (crenarchaeol) using ToF-SIMS and MALDI-MS. Spectra were analyzed for the molecular ion peak ([M]+ and [M]-), fragments and adducts. Two prokaryotes (the bacteria E. coli and the thaumarchaota N. viennensis) were analyzed using ToF-SIMS. The spectra of the prokaryotes were investigated using known biomark- ers for organic substances and subsequently with multivariate statistical tools (PCA and correlation coefficients). Furthermore in a bioinformatic subproject of this thesis an anal- ysis for two missing enzymes in the biosynthesis pathway of crenarchaeol was performed using cluster of orthologous genes, phylogenetic and biochemical considerations. Results and Summary It was possible to identify the molecule ion peak for the purified glycerol diphytanyl diethers with MALDI-MS but it was not possible to find the molecule ion peak for crenarchaeol in the MALDI-MS spectra. We were able to identify the molecule ion and the Na+ adduct peak of all analyzed molecules using ToF-SIMS but for crenarchaeol the intensity was very low. In the subsequent analysis of creanarchaeol in the membrane of entire prokaryotic cells this finding was not reproducible - only one fragment was found that might originate from crenarchaeol. ToF-SIMS analysis was often not able to reconstruct the contour of clusters of prokaryotes as seen in the microscope using high to medium molecular masses. Furthermore it was not possible to differ between single cells of archaea and also hardly possible to distinguish single E. coli cells - the lateral resolution and secondary ion yield was too little for organic medium to high molecular mass molecules. In addition it was not always possible to distinguish between biomass and non-biomass and the intensity of high-molecular mass peaks (above 600) was very low. The destruction of organic molecules on the surface and beneath by the erosion gun using Cs+ or O+2 in combination with the analysis gun using Bi+3 was most likely too severe. The statistical analysis (PCA) of mean-centered and normalized spectra showed that it was possible to distinguish between E. coli and N. viennensis. For the two missing enzymes in the biosynthesis pathway of crenarchaeol it was possible to give a ranked list of in silico predicted candidate genes, which should be used as a guideline for further research.

Autor*innen

Marcus Wieder

Haupttitel (Englisch)

Paralleltitel (Deutsch)

Spektrale Identifizierung von verschiedenen Glycerol-Diphytanylether als Reinsubstanz und Bestandteil der Zellmembran von Archaea

Publikationsjahr

2014

Umfangsangabe

132, 4 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Michael Wagner

Klassifikationen

35 Chemie > 35.23 Analytische Chemie: Allgemeines ,

35 Chemie > 35.26 Massenspektrometrie ,

42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie

AC Nummer

AC12086787

Utheses ID

29390

Studienkennzahl

UA | 066 | 863 | |

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Schlagwörter