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In situ ATR-FTIR spectroscopy study of organic and biological molecule-layers used in nanoscale biosensors and determination of surface concentrations
Manuel Punzet
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Annette Rompel
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Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
DOI
10.25365/thesis.33366
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29062.83686.326965-0
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Biosensoren in Form von Nanodrähten, deren Basis in Kontakt mit der zu analysierenden Substanz steht, sind vielversprechende Werkzeuge, um Molekülkonzentrationen bis in den Femtomolarbereich zu bestimmen. FTIR-ATR Spektroskopie wurde verwendet, um Protokolle zur Oberflächenmodifikation sowie Möglichkeiten zur Proteinanbindung zu untersuchen. Die Einzelstrahl-Probe-Referenz Methode wurde verwendet, um Wasserabsorption, Lösungsmittelabsorption und Unregelmäßigkeiten in den verwendeten Mehrfachreflektionselementen zu kompensieren. In einen Schritt-für-Schritt Prozess wurden Mehrfachreflektionselemente aus Silizium und Germanium mit Silanen modifiziert sowie verschiedene Proteine angebunden, damit die Oberfläche einem Biosensor gleicht. In einem Vorläuferexperiment wurde das Adhäsionsverhalten von Rinderserumalbumin (BSA) auf polierten und mit Silanen modifizierten Oberflächen studiert. In weiteren BSA Experimenten wurde die Oberflächenkonzentration unter Einfluss von verschiedenen Kochsalzkonzentrationen gemessen. Die resultierenden Oberflächenkonzentrationen lagen zwischen 1.5 e-12 und 2.4 e-12 Mol/cm2. Anbindungsexperimente mit Protein-Ligand Systemen wie Streptavidin/Biotin, Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) und dessen Antikörper und Prostata-spezifisches Antigen (PSA) und dessen Antikörper wurden durchgeführt und die Oberflächenkonzentrationen bestimmt. Um unspezifische Adhäsion von Proteinen zu vermeiden, wurden die resultierenden Oberflächen mit Ethanolamin passiviert. Die Oberflächenkonzentrationen von TNF-α lagen zwischen 1.7 e-13 und 2,73 e-13 Mol/cm2 und zwischen 1.6 e-13 und 1.7 e-13 Mol/cm2 für den TNF-α Antikörper. In den PSA Experimenten lagen die Oberflächenkonzentrationen zwischen 1.6 e-13 und 7.0 e-13 Mol/cm2. Beim PSA Antikörper zwischen 3.2 e-13 und 6.1 e-13 Mol/cm2. Das Funktionieren der Antikörperexperimente wurde durch das Bestimmen der Bindungsverhältnisse bewiesen. Das Verhältnis für das Tumornekrosefaktor-α System war 1,6 und für das Prostata-spezifisches Antigen System war das Verhältnis 3 bis 5. In einem letzten Experiment wurde eine Mehrfachreflektionselement aus Silizium mit 3- Aminopropyltrimethoxysilan modifiziert, um anschließend einen sulfo-SMCC Linker anzubinden. An den Linker wurde eine 20 Basenpaare lange Einzelstrang-DNA gebunden und die Komplementärsequenz eingespült, um einen DNA-Biosensor darzustellen. Die resultierenden Oberflächenkonzentration aller verwendeten Substanzen wurden versucht zu messen.
Abstract
(Englisch)
Biosensors of the nanowire type with gate electrodes in contact to the analyzing species are promising tools to determine molecule concentrations down to the femto molar range. FTIR-ATR spectroscopy was used to study the surface modification protocols and protein binding possibilities of prototype nanosensors. The single-beam sample-reference method was used to compensate absorptions of water vapor, solvent absorption and inhomogenities in the used multiple internal reflection element (MIRE). In a step-by-step process silicon and germanium MIREs were modified with a silane linker to covalently bind various protein molecules to the surface to mimic a biosensor setup. In preliminary experiments the adhesion behavior of bovine serum albumin (BSA) on polished and silane modified silicon surfaces was studied. In further BSA experiments the concentration of additional sodium chloride was varied and the resulting surface concentrations measured. Measured surface concentrations for BSA ranged from 1.5 e-12 to 2.4 e-12 Mol/cm2. In subsequent experiments protein-ligand systems with specific binding behavior such as streptavidin/biotin, tumor necrosis factor α/antibody and prostate specific antigen (PSA)/antibody were attached to the silan and the surface concentrations determined. To inhibit unspecific adhesion of protein molecules the silanized surface was passivated with ethanolamine. Protein surface concentrations ranged from 1.7 e-13 to 2,73 e-13 Mol/cm2 for tumor necrosis factor-α, from 1.6 e-13 to 1.7 e-13 Mol/cm2 for the TNF-α antibody. In the PSA experiments surface concentrations ranged from 1.6 e-13 to 7.0 e-13 Mol/cm2 and from 3.2 e-13 to 6.1 e-13 Mol/cm2 for the PSA-antibody. The validity of the antibody experiments was proved by determination of the binding ratios of antibody and antigen. The found ratios were 1.6 at maximum for tumor necrosis factor alpha and 3 to 5 for prostate specific antigen. In a final experiment a silicon MIRE was modified with aminopropyltrimethoxysilane (APTES). A sulfo-smcc crosslinker was bound to the surface and covalently connected with single-stranded DNA of 20 base-pairs. The complementary DNA strand was brought in contact to the resulting surface to mimic a DNA biosensor. Again it was tried to determine the surface concentrations of all involved molecules.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
biosensor FTIR-ATR BSA PSA TNF-alpha DNA
Schlagwörter
(Deutsch)
Biosensor FTIR-ATR BSA PSA Oberflächenkonzentration DNA TNF-alpha
Autor*innen
Manuel Punzet
Haupttitel (Englisch)
In situ ATR-FTIR spectroscopy study of organic and biological molecule-layers used in nanoscale biosensors and determination of surface concentrations
Paralleltitel (Deutsch)
In situ ATR-FTIR Spektroskopie Untersuchung von organischen und biologischen Molekül-Schichten, die in biologischen Nanosensoren verwendet werden, sowie Bestimmung der Oberflächenkonzentration
Paralleltitel (Englisch)
In situ ATR-FTIR spectroscopy study of organic and biological molecule-layers used in nanoscale biosensors and determination of surface concentrations
Publikationsjahr
2014
Umfangsangabe
75 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Angela Witte ,
Markus Galanski
Klassifikationen
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.30 Naturwissenschaften in Beziehung zu anderen Fachgebieten ,
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC12088197
Utheses ID
29635
Studienkennzahl
UA | 091 | 490 | |
Universität Wien, Universitätsbibliothek, 1010 Wien, Universitätsring 1