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Impact of the food matrix on allergenic properties of purified hazelnut allergens
Alexandra Spiller
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Merima Bublin
DOI
10.25365/thesis.33426
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29416.49094.188260-3
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Einleitung: Bisher weiß man wenig über die Interaktionen zwischen Proteinen und anderen
Lebensmittelbestandteilen wie diese die Immunantwort beeinflussen können. Es wird vermutet, dass
bestimmte Lebensmittelbestandteile, wie beispielsweise Lipopolysaccharide, Kohlenhydrate und Lipide
zur allergenen Wirkung von Proteinen beitragen können. Basierend auf dieser Hypothese wurde der
Einfluss von Lipiden der Haselnuss auf die Allergenizität von gereinigten Haselnussallergenen
untersucht.
Methoden: In einer ersten Reihe von Experimenten wurden zwei Hauptallergene der Haselnuss (Corylus
avellana), welche zur Familie der Prolamine gezählt werden, dem 2S Albumin, Cor a 14, und dem
nsLTP, Cor a 8, mittels eines mehrstufigen chromatographischen Verfahrens gereinigt. Anschließend
wurden die erhaltenen Fraktionen, von Cor a 14 und Cor a 8 durch physikalisch-chemische und
immunologische Methoden, einschließlich SDS-PAGE, 2D-SDS-PAGE, Zirkulardichroismus
Spektroskopie, MALDI-TOF Massenspektrometrie, N-terminale Sequenzierung, IgE-ELISA, Western
blotting untersucht. Weiters wurden zelluläre Histaminfreisetzungsssays und Proteinaufnahme
Experimente mit dendritischen Zellen (MODCs) durchgeführt.
Ergebnisse: Der Prozentanteil der Prolamin Fraktion aus dem gesamten Haselnussproteinextrakt betrug
7%, wovon 5% auf Cor a 14 und 2% auf Cor a 8 entfielen. Es konnten fünf unterschiedliche Protein-
Isoformen von Cor a 14 mit voneinander abweichenden molekularen Massen und isoelektrischen Punkten
isoliert werden. Die detaillierte Analyse einer der Isoformen, Cor a 14.2, mittels MALDI-TOF
Massenspektrometrie und 2D-SDS-PAGE zeigte, dass das reife Protein ein Molekulargewicht von 12
kDa aufwies und aus zwei durch Disulfidbrücken verbundene Untereinheiten mit Molekulargewichten
von 8 kDa and 4 kDa zusammengesetzt war. Anhand von Zirkulardichroismus-Spektroskopie konnte die
korrekte Faltung der Proteine Cor a 14.1, Cor a 14.2, Cor a 14.4 und Cor a 14.5 mit einer
Sekundärstruktur, die hauptsächlich aus für 2S Albumine typischen α-Helices bestand bestätigt werden.
Von Cor a 8 konnte eine Isoform mit einem Molekulargewicht von 9.4 kDa isoliert werden, deren
Identität durch N-terminale Sequenzierung verifiziert wurde. Die Bindung von IgE-Antikörpern konnte
für alle getesteten Proben von Cor a 14 und Cor a 8 durch Inkubation mit Seren von
haselnussallergischen Patienten mittels ELISA nachgewiesen werden. Basierend auf Ergebnissen von
IgE-ELISA und Western blotting kann angenommen werden, dass beide Allergene sowohl lineare als
auch konformationelle Epitope beinhalten.
Histaminfreisetzungs-Assays mit passiv sensibilisierten Basophilen der Ratte zeigten in vitro, dass die
gereinigten Proteine Cor a 14.1, Cor a 14.5 und Cor a 8 eine dosisabhängige Degranulation herbeiführten.
Mit Haselnussöl, im Gegensatz zu Cor a 14, konnte für Cor a 8 eine um 10-20% erhöhte
Histaminfreisetzung gemessen werden. Die durchgeführten Experimente mit MODCs erwiesen eine
verstärkte Aufnahme von Cor a 8, wenn Haselnussöl hinzugefügt wurde.
Schlussfolgerung: Es wurden Reinigungsprotokolle für zwei wichtige Haselnussallergene etabliert. In
vorläufigen Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass Haselnusslipide einen Einfluss auf die
Allergenizität von Cor a 8, aber nicht auf Cor a 14 zeigten. Es bleibt abzuklären, wie diese Allergene mit
Haselnusslipiden interagieren und wie Lipide die Sensibilisierungsphase und Effektorphase der IgEvermittelten
Haselnussallergie beeinflussen.
Abstract
(Englisch)
Introduction: So far, little is known about food matrix-protein interactions and how they modulate
immune responses. It has been hypothesized that food compounds, such as lipopolysaccharides,
carbohydrates and lipids, may contribute to the allergenicity of certain proteins. Based on these
considerations, we studied the impact of hazelnut derived lipids on the allergenic activity of two purified
hazelnut allergens.
Methods: In the first set of experiments two important hazelnut (Corylus avellana) allergens belonging to
the prolamin superfamily, the 2S albumin, Cor a 14 and nsLTP, Cor a 8, were purified by a multi-step
chromatographic procedure. Subsequently, final protein batches, containing different isoforms of Cor a 14
and one isoforms of Cor a 8 were characterized by physicochemical and immunological methods,
including SDS-PAGE, 2D-SDS-PAGE, CD spectroscopy, MALDI-TOF mass spectrometry, N-terminal
sequencing, IgE-ELISA, Western blotting, histamine release assays based on rat basophilic leukemia cells
(RBL assays) and protein uptake experiments using monocyte-derived dendritic cells (MODCs).
Results: The percentage of prolamin fraction was 7% of total hazelnut extract and contained about 5% of
Cor a 14 and 2% of Cor a 8. We isolated five different batches of Cor a 14, which varied in their
molecular weight and isoelectric point. MALDI-TOF MS and 2D-SDS-PAGE analysis of one of these
isoforms, Cor a 14.2, showed that the mature protein had a molecular weight of 12 kDa and consisted of
two subunits with molecular weights of 8 kDa and 4 kDa, linked by disulfide bonds. CD spectroscopy
verified that Cor a 14.1, Cor a 14.2, Cor a 14.4 and Cor a 14.5 were correctly folded, containing α-helices
as predominant secondary structure, which is typical for 2S albumins. For Cor a 8 we identified one
isoform with a molecular weight of 9.4 kDa, which was also confirmed by N-terminal sequencing. All
tested samples of Cor a 14 and Cor a 8 displayed IgE-binding capacity in IgE-ELISA by using sera of
hazelnut allergic patients. Both allergens possessed conformational as well as linear epitopes as have been
estimated by IgE-ELISA and Western blotting using native and denatured proteins.
Histamine release assays performed with Cor a 14.1, Cor a 14.5 and Cor a 8, demonstrated that all
purified proteins induced dose-dependent degranulation of passively sensitized RBL cells in vitro. In contrast to Cor a 14, in presence of hazelnut lipids Cor a 8 showed a 10-20% increased level of histamine
release. Uptake experiments with immature monocyte-derived dendritic cells (MODCs) showed enhanced
uptake of Cor a 8, when the protein was associated with hazelnut oil.
Conclusion: We established purification protocols for two important hazelnut allergens. Our preliminary
experiments pointed out that hazelnut lipids play a role in the allergenic activity of Cor a 8, but not of
Cor a 14. It remains to be investigated, how these allergens interact with hazelnut lipids and how lipids
influence the sensitization and effector phase of IgE-mediated hazelnut allergy.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
IgE-mediated food allergy hazelnut allergens lipids
Schlagwörter
(Deutsch)
IgE-vermittelte Nahrungsmittelallergie Haselnuss Allergene Lipide
Autor*innen
Alexandra Spiller
Haupttitel (Englisch)
Impact of the food matrix on allergenic properties of purified hazelnut allergens
Publikationsjahr
2014
Umfangsangabe
96 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Merima Bublin
Klassifikationen
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
44 Medizin > 44.45 Immunologie
AC Nummer
AC12033042
Utheses ID
29694
Studienkennzahl
UA | 066 | 877 | |