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Endothelial-cell derived microparticles influence clotting time in thromboelastometry

Cornelia Bonstingl

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Chemie

Betreuer*in

Heinz Redl

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URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-30382.78859.441954-1

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Seit langem ist schon bekannt, dass Endothelzellen die Blutgerinnung modulieren. Erst kürzlich konnte das Ludwig Boltzmann Institut für Experimentelle und Klinische Traumatologie zeigen, dass Endothelzellen als auch Überstände von Endothelzellen aus der Zellkultur zur Blutgerinnung beitragen. Nach der Zugabe von Zellkulturüberständen zu frischem Blut konnte eine Reduktion der viskoelastisch gemessenen Gerinnungszeit beobachtet werden, die mit Hilfe von einem Antiköper gegen Gewebefaktor normalisiert werden konnte. Das Ziel der Arbeit war herauszufinden, ob Mikropartikel, die aus Endothelzellkulturüberständen isoliert werden, einen Einfluss auf die Blutgerinnungszeit, gemessen mittels Thromboelastometrie, haben. Mikropartikel sind kleine Vesikel mit einer Größe von 0.1 – 1 µm, die bei Zellstimulation ausgeschüttet werden. Somit sollte die Ausschüttung der Mikropartikel nach Stimulation der Endothelzellen mit Tumor-Nekrose Faktor (TNF-α) erhöht sein. Am wichtigsten war es herauszufinden, ob Gewebefaktor in den Zellkulturüberständen löslich oder an Mikropartikel-gebunden ist. Zu diesem Zweck wurden Endothelzellen mit TNF-α bis zu 24 Stunden stimuliert und danach ultrazentrifugiert. Mikropartikel, die nach Zentrifugationen von 14 000 xg (P14) und 100 000 xg (P100), isoliert werden konnten, wurden mit Zitrat antikoaguliertem Blut vermischt und mittels Rotationsthromboelastometrie (ROTEM) analysiert. Zudem wurden Experimente mittels Durchflusszytometrie durchgeführt um die Mikropartikel zu quantifizieren bzw. um auf diesen Gewebefaktor auf diesen zu detektieren. Die Ergebnisse zeigten, dass eine höhere Menge an prokoagulatorischen Faktoren durch TNF-α induzierte Endothelzellstimulation ausgeschüttet wurde in Vergleich zu unstimulierten Endothelzellen. Nach differentieller Zentrifugation zeigten beide Pellets (P14 und P100), die Mikropartikel enthielten, eine signifikante Reduktion der Gerinnungszeit, während der partikelfreie Überstand (S100) die Blutgerinnung kaum aktivierte. Die Verringerung der Gerinnungszeit konnte durch die Inhibition von Gewebefaktor in den Pellets P14 und P100, in denen beiden Partikel gefunden wurden, reversiert werden. Die Reduktion der Gerinnungszeit ausgelöst von den Pellets stammt höchstwahrscheinlich von Mikropartikel-gebundenem Gewebefaktor. Die Vermutung konnte durch die Verwendung von Durchflusszytometrie bestätigt werden: Im Pellet P14 wurden sowohl Partikel mit Gewebefaktor als auch Phosphatidylserin detektiert (Phosphatidylserin ist ein typischer Marker für Mikropartikel). Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass Mikropartikel aus den Zellkulturüberständen von Endothelzellen mittels einer differentiellen Zentrifugation isoliert werden können. Dies Mikropartikel können in Durchflusszytometrie entsprechend detektiert werden und führen zu einer Beschleunigung der Blutgerinnung im Vollblut, nachgewiesen durch die Thromboelastometrie. Die Arbeit konnte zeigen, dass es sich bei prokoagulatorischen Faktoren, die von Endothelzellen unter TNF-α Stimulation ausgeschüttet werden, höchstwahrscheinlich um Gewebefaktor-tragende Mikropartikel handelt.

Abstract

(Englisch)

Endothelial cells are well known for modulating haemostasis. Recent studies in the laboratory of the Ludwig Boltzmann Institute for Experimental and Clinical Traumatology could however show that endothelial cells as well as their culture supernatants accelerated blood coagulation. An incubation of whole blood with endothelial cell culture supernatants reduced viscoelastic clotting time. This effect could be reversed by an antibody against tissue factor. The aim of the current study was to isolate microparticles from endothelial cell culture supernatants and evaluate their effect on clotting time in rotational thromboelastometry (ROTEM). Microparticles are 0.1 – 1 µm small vesicles released upon cell stimulation. Therefore an up-regulation of microparticle release upon tumour-necrosis factor alpha (TNF-α) stimulation should be noticeable. Most important was to reveal if tissue factor can be found rather soluble or microparticle-bound in the endothelial cell culture supernatants. For this purpose endothelial cells were stimulated with TNF-α up to 24 hours and subjected to ultracentrifugation. Microparticles concentrated into a pellet resulting from a centrifugation at 14 000 xg (P14) and 100 000 xg (P100) were mixed with recalcified citrated whole blood and analysed by thromboelastometry. Furthermore flow cytometry experiments were used to quantify of particle presence and to confirm tissue-factor presence on those particles. The results showed that more procoagulatory mediators were released by endothelial cells upon TNF-α stimulation in comparison to non-stimulated cells. Following the differential centrifugation both pellets P14 and P100 harvesting microparticles (amongst others), showed a significant clotting time reduction, while the particle-free supernatant S100 did not activate coagulation significantly. Clotting time reduction could be reversed in the particle-bearing pellets P14 and P100 after tissue factor inhibition with an antibody. The reversion for the pellets is most likely coming from microparticle-bound tissue factor. This could be confirmed by flow cytometry: In P14 tissue factor and phosphatidylserine (a common microparticle marker) positive particles were detected. In conclusion, microparticles coming from endothelial cell culture supernatants could be separated via differential centrifugation and were assessed with flow cytometry and accelerated whole blood coagulation measured via thromboelastometry. In this thesis it could be shown that procoagulatory mediators released by endothelial cells upon TNF-α stimulation are most likely tissue-factor bearing microparticles.

Autor*innen

Cornelia Bonstingl

Haupttitel (Englisch)

Endothelial-cell derived microparticles influence clotting time in thromboelastometry

Paralleltitel (Deutsch)

Von Endothelzell-gebildete Mikropartikel beeinflussen Blutgerinnung in der Thromboelastometrie

Publikationsjahr

2014

Umfangsangabe

88 S.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Heinz Redl

Klassifikationen

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines ,

35 Chemie > 35.70 Biochemie: Allgemeines

AC Nummer

AC11748563

Utheses ID

29722

Studienkennzahl

UA | 066 | 863 | |

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