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Genome-wide analysis of Notch function in early T cell development
Markus Schäfer
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Meinrad Busslinger
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30197.08299.858869-9
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
T-Zellen sind ein zentraler Bestandteil der adaptiven Immunabwehr, die für ihre Entwicklung die besondere Mikroumgebung des Thymus benötigen. Nach dem Eintritt in den Thymus sind lymphoide Vorläuferzellen einer hohen Dichte an Notch Liganden ausgesetzt, was dazu führt, dass in den Vorläuferzellen ein T-Zellentwicklungs-spezifisches Genexpressionsprogramm aktiviert wird. In frühen T-Zellstadien dient Notch dem Determinierungsprozess der Zellen in Richtung T-Zelllinie. In späteren Entwicklungsstadien hingegen reguliert Notch das Überleben der Zellen, sowie die Zellteilung und die weitere Zellentwicklung. Die zentrale Rolle des Notch-Signalweges in der T-Zellentwicklung ist eingehend bekannt und es konnten einige Zielgene von Notch gefunden werden. Bisher wurde jedoch noch keine systematische Analyse durchgeführt, um das von Notch induzierte molekulare Programm in verschiedenen T-Zellentwicklungsstadien zu entschlüsseln. Angesichts fehlender molekularer Werkzeuge war bis heute das Auffinden direkter Notch-Zielgene auf Studien in Zelllinien beschränkt und wurde meist unter artifiziell erhöhten Notch-Signalen durchgeführt.
Um diese Einschränkungen zu umgehen, habe ich murine Knock-in Allele von Notch1 und dem DNA-bindenden Co-Faktor Rbpj verwendet, die unter anderem für eine Biotinylierungssequenz kodieren. Ich habe eine Kombination aus ChIP-seq und RNA-seq Ansätzen angewendet, um eine umfassende Kartierung des Notch-regulierten Transkriptoms während der T-Zellentwicklung zu erstellen – in undeterminierten T-Vorläuferzellen sowie T-Zellliniedeterminierten pre-T-Zellrezeptor (pre-TCR) negativen DN3a und pre-TCR-positiven DN4 Thymozyten. Um potentielle cis-regulatorische Elemente zu beschreiben, die von Notch für die Regulation der Transkription der Zielgene genutzt werden, habe ich ebenfalls DNase I hypersensitive Stellen, Transkriptionsstartstellen und Histonmodifikationen in DN3a Thymozyten kartiert. Diese Ansätze haben zahlreiche neue Notch Zielgene identifiziert; unter anderem eine unerwartete Gruppe von Genen, die in den frühesten Thymozyten von Notch aktiviert werden und wiederum sogleich herabreguliert werden, bevor die Zellen den T-Zellliniendeterminationspunkt erreichen. Innerhalb dieser Gruppe sind Gene angereichert, die in der Regel in hohem Maße in natürlichen Killerzellen oder in myeloiden Zellen exprimiert werden.
Es wurde gezeigt, dass der Notch-Signalweg für die Rearrangierung des Tcrb Lokus benötigt wird. Jedoch konnte dafür bisher keine Erklärung auf molekularer Ebene erbracht werden. Ich habe zum einen eine deutliche Bindung von Notch1 und Rbpj an dem TCRbeta Enhancer festgestellt. Zum anderen verstärkte die Aktivierung von Notch in Vorläuferzellen aus dem Knochenmark die Expression von „sterilen“ Tcrb Transkripten. Diese Ergebnisse könnten eine molekulare Erklärung für die Funktion von Notch in der Rearrangierung des Tcrb Lokus darstellen.
Unerwarteterweise und konträr gegenüber der gängigen Lehransicht des Notch-Signalweges, die besagt, dass Rbpj an die DNS bindet, auch wenn der Notch-Signalweg inaktiv ist, haben meine Resultate eine Notch-abhängige Bindung von Rbpj an der Mehrzahl der Bindestellen gezeigt.
Es ist bekannt, dass die Signalstärke des Notch-Signalweges nach der Expression eines pre-TCR nachlässt. In pre-TCR-exprimierenden Zellen erfüllt der Notch-Signalweg jedoch immer noch eine mitogene Funktion. Dies könnte bedeuten, dass die Transition zur Änderung des Zielgenspektrums von Notch führt. Vergleiche der genomweiten Bindung von Rbpj in DN3a und DN4 Zellen sowie der Notch-regulierten Transkriptionsprofile in beiden Zellstadien zeigten, dass in pre-TCR-positiven Zellen keine neuen Notch-Zielgene hervorgehen, die nicht schon vor der Ausbildung des pre-TCR durch Notch reguliert werden.
Abstract
(Englisch)
Abstract
Acquired immunity to pathogens critically depends on functional T cells, which require the unique microenvironment of the thymus for their development. Exposure of thymus-seeding progenitors to Notch ligands expressed by thymic stroma initiates execution of the T cell differentiation program. Notch functions as the T lineage commitment factor at the early stages of differentiation and is required for survival, proliferation and further developmental progression later on. Although the importance of Notch signalling in T cell differentiation is long-established and some Notch target genes important in this process were identified, no systematic attempt to characterise the molecular program downstream of Notch signalling in developing T cells was made so far. In fact, due to the lack of appropriate tools until today, a systematic search for Notch targets in any system was largely restricted to studies in cell lines and conditions of artificially overactivated Notch signalling.
To bypass this limitation, I made use of biotin-tagged murine knock-in alleles of Notch1 and its DNA-binding cofactor Rbpj generated in our research group. I combined ChIP-seq and RNA-seq approaches to generate a comprehensive map of the Notch-regulated transcriptome throughout T cell development—in uncommitted T cell progenitors as well as T lineage-committed pre-beta-selection DN3a cells and post-beta-selection DN4 thymocytes. To identify putative cis-regulatory elements, through which Notch controls expression of its target genes, I mapped DNase I hypersensitive sites, transcription start sites and histone modifications in DN3a thymocytes. These approaches led to the identification of a number of novel Notch targets, including an unexpected group of genes that are induced by Notch signalling in the earliest thymocytes but are rapidly downregulated by the time of commitment to the T cell lineage. This group is enriched for genes, which are commonly expressed in natural killer or myeloid cell lineages.
It was previously reported that Notch signalling is required for rearrangement at the Tcrb locus, but the molecular mechanism for this remained unknown. I identified prominent Notch1 and Rbpj occupancy in the TCRbeta enhancer and demonstrated that activation of Notch signalling in bone marrow progenitors enhanced germline transcription of the Tcrb locus. These results provide a likely molecular explanation for the role of Notch in TCRbeta recombination. Unexpectedly, in contrast to the textbook view on the Notch pathway, which suggests that Rbpj is constantly bound to DNA even in the absence of Notch signalling, my results revealed Notch-dependent Rbpj binding at the majority of sites.
Finally, although Notch signalling strength is known to decrease upon pre-TCR expression, Notch acquires a mitogenic function at this transition, suggesting that a spectrum of its target genes may change. The comparison of the Notch-regulated transcriptomes of DN3a and DN4 cells showed that Notch targets in pre-TCR-positive cells represent a subset of Notch targets prior to pre-TCR expression and that no new Notch targets emerge at this transition.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Notch Rbpj Thymocytes ChIP-seq RNA-seq
Schlagwörter
(Deutsch)
Notch Rbpj T Lymphozyten ChIP-seq RNA-seq
Autor*innen
Markus Schäfer
Haupttitel (Englisch)
Genome-wide analysis of Notch function in early T cell development
Paralleltitel (Deutsch)
Genomweite Analyse der Funktion von Notch während der frühen T-Zellentwicklung
Publikationsjahr
2014
Umfangsangabe
254 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Ludger Klein ,
Hans-Reimer Rodewald
AC Nummer
AC11834657
Utheses ID
29931
Studienkennzahl
UA | 094 | 490 | |