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Expression and purification of recombinant surface proteins G and F of Human Respiratory Syncytial Virus (HRSV)

Kristina Borochova

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Rudolf Valenta

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DOI

10.25365/thesis.33765

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-30261.06662.565761-8

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Herstellung und Charakterisierung rekombinanter Oberflächenproteine G (“Attachment“ Protein) und F (“Fusion“ Protein), des Humanen Respiratorischen Syncytial Virus (HRSV), welcher der Familie der Paramyxoviridae und der Gattung der Pneumoviren zuzuordnen ist. Dieser Krankheitserreger spielt bei Infektionen der oberen und unteren Atemwege eine bedeutende Rolle und führt insbesondere bei Säuglingen, Kindern, älteren sowie immungeschwächten Personen oftmals zu lebensbedrohlichen Erkrankungen des respiratorischen Traktes. Im Detail handelt es sich um einen umhüllten Virus mit einzelsträngiger negative-sense RNA als Genom, welcher über eine Genomgröße von ca. 15,2 kB verfügt, die für die Codierung von 11 Proteinen verantwortlich sind. Auf der viralen Hülle befinden sich die Oberflächenproteine F, G und SH (“small hydrophobic“ Protein), wobei vor allem das Oberflächen-Glykoprotein G bzw. dessen Sequenzvariabilität für die weitere Klassifizierung in HRSV-Subtype A und Subtype B herangezogen wird. Die beiden anderen Proteine zeigen eine deutlich geringere (SH) bzw. fast keine Sequenzvariabilität (F). Bis dato existieren nur wenige Studien, welche erfolgreich zeigen konnten, dass HRSV Oberflächenproteine in E.coli exprimiert werden können. Aus diesem Grund war das Hauptziel dieser Arbeit die Konstruktion, Expression und Reinigung der HRSV Oberflächenproteine G sowie der Subeinheiten F1 und F2 des F Proteins. Im ersten Schritt wurde eine genaue Sequenzanalyse der viralen Oberflächenproteine unterschiedlicher HRSV Subtypen durchgeführt. Die Aminosäure Sequenzen wurden aus der NCBI Datenbank bezogen und unter Verwendung der Software Clustal W miteinander verglichen und anschließend anhand ihrer Ähnlichkeiten gruppiert. A2, welcher zur HRSV Subtype A gehört sowie BA welche der Subtype B zuzuordnen ist, wurden ausgewählt und für die Produktion rekombinanter Proteine sowie synthetischer Peptide verwendet. Für die Herstellung der rekombinanten Proteine wurde zunächst ein Hexahistidin-Tag (6xHis) an den 3` Enden der codon-optimierten cDNAs angebracht, um die spätere Reinigung mittels Ni-NTA Affinitätschromatografie zu erleichtern. Die modifizierten Nukleinsäurestränge, welche für die Protein-Subeinheiten F1 und F2 sowie das Protein G kodieren, wurden anschließend in das pET-27b Plasmid innerhalb der NdeI/XhoI Restriktionsseiten eingefügt. Die Expression der rekombinanten Proteine erfolgte in E. coli BL 21 (DE3) Zellen. Jede Kultur wurde von einer einzelnen transformierten E. coli Kolonie gewonnen und in 1L LB-Medium mit Zusatz eines passenden Antibiotikums in einem Schüttelinkubator bei 37°C inkubiert. Sobald der OD600nm Wert von 0.5 erreicht wurde, erfolgte die Zugabe von IPTG um die Expression des Zielproteins zu induzieren. Im nächsten Schritt wurden die Zellen durch Zentrifugation vom Medium getrennt und durch chemische sowie mechanische Maßnahmen aufgeschlossen. Die rekombinanten Proteine wurden anschließend von anderen kontaminierenden Bestandteilen unter nativen oder denaturierenden Bedingungen auf einer Ni-NTA Säule gereinigt. Während der Reinheitsgrad durch eine SDS-PAGE Analyse bestimmt wurde, kam für den Nachweis der Proteinidentität ein Western-Blot (Anti-His-Tag-Antikörper) zur Anwendung. Abschließend kam es zu einer Charakterisierung der gewonnenen Proteine anhand ihrer physikochemischen Eigenschaften, welche mittels Zirkulardichroismus-Spektroskopie sowie MALDI TOF-Analyse ermittelt wurden. Zusätzlich zu den rekombinanten Proteinen wurden synthetische Peptide hergestellt, welche das gesamte Oberflächen-Glykoprotein G überspannen. Dazu wurde die Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) Festphasen Peptid Synthese unter Verwendung eines PEG-PS enthaltenden Matrix genutzt. In weiterer Folge wurden die Peptide mit Dichlormethan gewaschen und von der Matrix befreit. Dafür kam ein Gemisch aus 95%iger Trifluoressigsäure (TFA) und 3.5 %igem Silane zum Einsatz. Anschließend erfolgte die Präzipitation in kaltem tert-Butylmethylether. Die Entfernung von unerwünschten Nebenprodukten wurde mittels eines 10 -70 %igem Acetonitril Gradienten im Zuge einer Reversed-Phase-HPLC erreicht. Zur Feststellung der korrekten Peptididentität kam erneut die MALDI-TOF Spektrometrie zum Einsatz. Peptidfraktionen mit einem hohen Reinheitsgrad sowie hoher Intensität im Massenspektrum wurden abschließend lyophilisiert und bei -20°C gelagert. Zusammenfassend wurden während dieser Masterarbeit zwei rekombinante virale Oberflächenproteine und 16 synthetische Peptide des G Proteins hergestellt. Diese Proteine und Peptide können in weiterer Folge für die Entwicklung von serologisch diagnostischen Assays verwendet werden, welche die Antikörperantwort auf eine HRSV Infektion messen. Dadurch können unter Umständen neue Erkenntnisse gewonnen werden, welche als Grundlage für die Entwicklung neuer und innovativer Diagnose und Therapieverfahren dienen.

Abstract

(Englisch)

The major focus of my master thesis was the production of recombinant proteins and synthetic peptides derived from the Human Respiratory Syncytial Virus (HRSV). This pathogen is an important causal agent of severe respiratory tract infections in infants and children as well as in elderly and immunodeficient persons. The HRSV belongs to the Pneumovirus genus of the Paramyxoviridae family. It is an enveloped virus with a negative-sense single-stranded RNA genome of approximately 15,2 kb which encodes for 11 proteins. This pathogen exists as a single serotype with two antigenic subgroups A and B. Genotyping of HRSV-A and HRSV-B viruses is mainly based on the sequence variability of the surface “G” attachment glycoprotein. The other two proteins on the viral surface, “SH” small hydrophobic protein and “F” fusion glycoprotein, show low or no relevant sequence variability, respectively. Only few studies reported the successful expression of HRSV surface proteins in bacteria. Therefore, the major aim of my master thesis was to construct, express and purify HRSV surface protein G and F protein subunits, F1 and F2. In a first step, a detailed sequence analysis of viral envelope proteins from different HRSV strains was performed. Amino acid sequences were retrieved from the NCBI database, aligned using Clustal W and grouped according to the percentages (%) of amino acid sequence identities. Two representative HRSV strains were then selected: A2- belonging to the HRSV genotype A and BA- belonging to HRSV group B, respectively. Next, synthetic genes coding for F and G surface proteins were made based on a codon-usage optimized for the expression in Escherichia coli. The cDNAs were synthesized with the addition of a sequence encoding a hexahistidine tag at the 3` end and inserted into the NdeI/XhoI site of the pET-27b vector. The HRSV surface proteins G and both F protein subunits were expressed in E. coli BL21 (DE3). Each culture derived from a single E. coli colony and the expression of the target protein was induced by adding IPTG. Cells were harvested by centrifugation and lysed by chemical and mechanical homogenization. Recombinant proteins were purified under native or denaturing conditions from the soluble or insoluble fractions using Ni-NTA resin, respectively. The purity and correct identity of the proteins was analyzed by SDS-PAGE and Western-blot, using monoclonal anti-His-tag antibodies, respectively. Proteins were also characterized in relation to their physicochemical properties, including the measurement of circular dichroism (CD) spectra and the determination of molecular masses using MALDI-TOF analysis. In addition to recombinant proteins also synthetic peptides spanning the surface glycoprotein G were synthesized by solid phase synthesis with the 9-fluorenyl-methoxy-carbonyl-method, using a PEG-PS preloaded resin. Subsequently, peptides were washed with dichlormethan, cleaved from the resin in 95% TFA, 2.5% Silane and precipitated into tert-Butylmethylether. Separation from by-products was achieved by reversed-phase HPLC in an 10-70% acetonitrile gradient and the identity of the peptides was confirmed by mass spectrometry. The mass spectrum of each fraction was analyzed using Flex analysis software. High intensity lines with the right molecular weight of the peptide were identified and fractions of the same composition were pooled together and finally lyophilized. Taken together, two recombinant HRSV surface proteins and 16 synthetic peptides were produced during the course of my master thesis. These proteins and peptides may subsequently be used to establish a serological diagnostic assay measuring antibody responses to HRSV following experimental human infection. Analysis of HRSV-specific antibody responses may provide new insights for the development of new and innovative diagnostic tools or therapeutic agents.

Autor*innen

Kristina Borochova

Haupttitel (Englisch)

Expression and purification of recombinant surface proteins G and F of Human Respiratory Syncytial Virus (HRSV)

Paralleltitel (Deutsch)

Expression und Reinigung rekombinanter Oberflächenproteine G und F des Humanen Respiratorischen Syncytial Viruses

Publikationsjahr

2014

Umfangsangabe

83 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Rudolf Valenta

Klassifikationen

42 Biologie > 42.03 Methoden und Techniken der Biologie ,

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,

42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie ,

42 Biologie > 42.32 Virologie

AC Nummer

AC12140334

Utheses ID

29982

Studienkennzahl

UA | 066 | 830 | |

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Schlagwörter