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Development of an online digestion method for the assessment the human embryo secretome
Philipp Obermayr
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Andreas Rizzi
DOI
10.25365/thesis.33768
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30461.01101.745664-8
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Das Forschungsfeld „Proteomics“ befasst sich mit der qualitativen und (relativen) quantitativen Analyse der Gesamtheit der Proteine in Zellen, subzellulären Organel-len, Geweben, in Körperflüssigkeiten und Sekreten oder sogar in gesamten Orga-nismen. Derzeit werden dafür im Wesentlichen zwei unterschiedliche Strategien eingesetzt, einerseits die Analyse nach Auftrennung der intakten Proteine, der sogenannte „top-down“-Ansatz, und andererseits die Analyse der Proteine nach deren Spaltung in Peptide, der sogenannte "bottom-up" Ansatz. Letzterer umfasst zumeist eine enzymatische Spaltung der Proteine in Peptide an definierten Spaltstellen ("Proteinverdau"). Dieser Proteinverdau ist dabei in zeitlicher Hinsicht der Flaschenhals jedes "bottom-up" Experiments. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung einer Analysenmethode, die einen online Verdau beinhaltet, bei der Enzymreaktoren mit immobilisiertem Trypsin zum Einsatz kommen, um schnelle Proteom-Analysen zu ermöglichen. Zukünftig soll diese Methode unter anderem für die Analyse des Sekretoms von humanen Embryonen, die für In-Vitro Fertilisation gezüchtet wurden, eingesetzt werden. In diesem Falle ist das rasche Vorliegen von Daten zur Beurteilung der Embryonen besonders wichtig.
Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit Probenvorbehandlung und der Opti-mierung eines mobile Phase-Gradienten für die Auftrennung tryptischer Peptide mittels High Performace Liquid Chromatography (HPLC). Die Proben wurden unter verschiedenen denaturierenden Bedingungen behandelt, wobei sich Harnstoff für die Denaturierung der Proteine als sehr gut geeignet erwies, während sich das Surfactant Rapigest störend auf das Gesamtsystem auswirkte. Als mobile Phase-Gradient wurde ein ternärer Gradient mit Acetonitril, Methanol und Trifluorethanol als organische Lösungsmittelkomponenten entwickelt.
Der größte Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Wahl und "Optimierung" der Ver-dau-Bedingungen im Enzymreaktor. Das pH Optimum lag dabei, wie erwartet, zwi-schen 7,5 und 8,5, und von den getesteten Puffersubstanzen erwies sich Ammo-niumacetat als das am besten geeignete. Bezüglich des Einflusses von organischen Lösungsmittelkomponenten erwies sich, dass Acetonitril in einer Konzentration von 10% die Verdaueffizienz steigert, ebenso wie die Zugabe von 2M Harnstoff in die Pufferlösung. Als weitere Parameter wurde der Einfluss von Verdautemperatur und Verdauzeit, bestimmt durch die Flussrate, untersucht. Dabei erwies sich eine Temperatur von 40°C als geeignet. Der Einfluss der Flussrate auf die Verdaueffizienz war geringer als erwartet, es stellte sich ein Volumenfluss von 7 µl/min, entsprechend einer Verweildauer im Trypsin-Reaktor von 14 min, als guter Kompromiss dar.
Als ein besonderes Problem stellte sich die Verschleppung der Probe durch Adsorp-tion im Trypsin-Reaktor heraus. Weder das Waschen mit organischen Lösungsmit-teln, noch das mit hoch konzentrierten Salzlösungen konnte diesen Effekt wesentlich reduzieren. Es wurde hingegen deutlich, dass mit der Steigerung der Verdau-Effizienz auch die Verschleppungseffekte reduziert werden konnten.
Ein wichtiger Punkt dieser Studie war die Konfigurierung eines Gesamt-Chromatographie-Systems, das hohen Probendurchsatz und online Verdau mit kur-zen Aufenthaltszeiten im Reaktor erlaubt. Dafür wurde ein System entworfen, das aus jeweils zwei Trypsin-Reaktoren, zwei Vorsäulen und zwei Trennsäulen besteht. Mit diesem System wurde es möglich, die Wasch-und Equilibrierungszeiten zu erhöhen, die Analysendauer aber dennoch zu senken.
Schlussendlich wurde die neu entwickelte Methode anhand von IVF-Proben mit einer Standardmethode verglichen. Als vorläufiges Ergebnis konnte festgestellt werden, dass die vorgestellte Methode mit online Verdau für die Analytik von komplexen Proben geeignet ist.
Abstract
(Englisch)
The research area of “proteomics” deals with the qualitative and (relative) quantitative analysis of the entire complement of proteins in cells, sub-cellular organelles, tissues, in body fluids or even in whole organisms. Currently, basically two different strategies are applied. On the one hand, in the so called “top down” approach, intact proteins are separated and then analyzed. On the other hand, in the so called "bottom-up" approach, proteins are enzymatically cleaved into peptides with defined cleavage sites ("protein digestion") before analysis. Protein digestion is the bottleneck of every bottom up proteomic experiment in terms of time consumption. In order to enable fast proteomic analyses, a method for online protein digestion is developed in this work, using immobilized trypsin reactors. In future, this method should be used for the analysis of the secretome of human embryos grown for in vitro fertilization (IVF). In this field of application, short analysis times are mandatory.
The first part of this work comprises the development of suitable sample preparation conditions as well as an eluent gradient for the separation of tryptic peptides with high performance liquid chromatography (HPLC). Samples were treated with different denaturing agents, of which urea was found to be well suited for the denaturing of proteins, whereas the Rapigest surfactant interfered with our system. As mobile phase gradient, a ternary gradient with acetonitrile, methanol and triflouroethanol as organic modifiers was developed.
The major part of this work deals with finding and “optimizing” appropriate digestion conditions for an immobilized enzyme reactor (IMER). As expected, the pH optimum for the IMER was between pH 7.5 and 8.5. Several different buffer substances were tested, of which ammonium acetate turned out being the most appropriate buffer salt. Regarding the addition of organic solvents to the buffer solution, it turned out that acetonitrile at a concentration of 10% could increase the IMER efficiency. A similar effect could be attained by addition of 2M urea to the buffer solution. As further parameters, the influence of digestion temperature and digestion time, controlled by the flow rate, have been investigated. A temperature of 40°C was shown to be appropriate. The flow rate did not have as great an impact as we had anticipated, being optimal at 7 µl/min, corresponding to a dwell time in the IMER of 14 min.
In the course of the study, memory effects caused by the IMER turned out being a major issue. Neither washing steps with organic solvents, nor those with high salt solutions could significantly reduce these effects. However, it was shown that the enhancement of digestion efficiency of the IMER was effective in reducing the carryover effect.
A further important point of the work was setting up a complete HPLC system suita-ble for high throughput online digestion analyses. Eventually, a system consisting of two IMER's, two trap columns and two separation columns has been developed, which allows parallel runs. In this way, the run time could be reduced while washing and equilibration time was enhanced.
Finally, the newly developed method was compared with a standard bottom up pro-teomic approach using IVF-samples. As preliminary result, it could be shown that the online digestion method is suited for the analysis of complex proteomic samples.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
proteomics IVF
Schlagwörter
(Deutsch)
Proteomics IVF
Autor*innen
Philipp Obermayr
Haupttitel (Englisch)
Development of an online digestion method for the assessment the human embryo secretome
Paralleltitel (Deutsch)
Entwicklung einer online-Verdau Methode für die Beurteilung des Sekretoms humaner Embryos
Publikationsjahr
2014
Umfangsangabe
86 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Andreas Rizzi
Klassifikation
35 Chemie > 35.23 Analytische Chemie: Allgemeines
AC Nummer
AC12099201
Utheses ID
29984
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |