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The central body of the cyanelles of Cyanophora paradoxa

a eukaryotic carboxysome?

Sara Fathinejad

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Wolfgang Löffelhardt

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DOI

10.25365/thesis.411

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29798.10643.568053-1

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Die Photosynthese stellt die Grundlage des Lebens auf unserem Planeten in seiner heutigen Form dar. Neben der Landpflanzen spielen die Algen und die Cyanobakterien eine wesentliche Rolle bei der globalen Kohlendioxid-Fixierung und tragen damit zum derzeit noch annähernd bestehenden Gleichgewicht zwischen der Produktion und dem Verbrauch des (Treibhaus-Gases) bei. Angesichts der relativ geringen Affinität des Schlüsselenzyms Ribulose-1,5-bisphosphatcarboxylase (Rubisco) für sein Substrat ist die Kohlendioxidkonzentration in der Atmosphäre (0.037%) tatsächlich als zu niedrig anzusehen. Im Verlauf der Evolution haben zunächst die Cyanobakterien, dann die durch Endosymbiose aus ihnen entstandenen Algen und schließlich die höheren Pflanzen Kohlendioxid- Konzentrierungsmechanismen (CCM) entwickelt, um dieses Manko auszugleichen. Cyanophora paradoxa ist die am besten charakterisierte einzellige Alge aus der Gruppe der Glaucocystophyta. Sie enthält photosynthetisierende Plastiden (Cyanellen), welche von einer zwischen den Envelopemembranen liegenden Peptidoglykanschicht, ähnlich wie bei den Cyanobakterien, umgeben sind. Dieses Merkmal lässt erkennen, dass diese Plastiden eine Modell für eine frühe Stufe in der Evolution der Organellen darstellen. In jeder Cyanelle befindet sich ein elektronen-dichter Zentralkörper, der den Großteil der vorhandenen Ribulose-1,5-bisphosphat- Carboxylase/Oxygenase (Rubisco) beinhaltet. Vermutlich ist der Zentralkörper von C. paradoxa die wesentliche Struktur für den CO2-Konzentrierungs-Mechanismus (CCM) und entspricht daher den cyanobakteriellen Carboxysomen oder den Pyrenoiden in Algen. Ein mögliches Szenario für die Evolution des CCM postuliert, dass Cyanobakterien schon vor dem primären endosymbiotischen Ereignis Carboxysomen entwickelt haben und nach der Endosymbiose der cyanobakterielle CCM umgestaltet wurde zu einem Algen-CCM. Die ungewöhnlichen Plastiden von C. paradoxa zeichnen sich neben ihrer Peptidoglykanschicht noch durch mehrere cyanobakterielle Eigenschaften aus. Daher unsere Annahme, dass die Cyanellen der Glaucocystophyta einen cyanobakteriellen Zentralkörper besitzen, um sich mittels eines cyanobakteriellen CCM durch veränderte Genexpression an niedrig-CO2 Zustände anpassen zu können („Acclimation“). Im Rahmen dieser Arbeit sollten Zentralkörper und CCM von C. paradoxa erforscht werden und beteiligte Proteine (d.h. homologe Proteine zu Carboxysom- und/oder Pyrenoid- Komponenten) identifiziert werden. Eine Isolierungsmethode für Zentralkörper wurde entwickelt, um Massenspektrometrie an im Gel verdauten Banden aus SDS-PAGE zu ermöglichen. Zwei cDNA Libraries wurden gemacht, aus Zellen unter unterschiedlichen Wachstumsbedingungen, nämlich hoch- und niedrig-CO2. An der University of Illinois wurde mittels High-Throughput Sequenzierung von 4992 Klonen eine Sammlung von Expressed Sequence Tags (ESTs) geschaffen (durch S. Burey). Unter den häufig vorkommenden Transkripten befanden sich auch Gene, die möglicherweise eine Funktion im CCM haben. Mittels Microarray-Technologie konnte das mengenmäßige Verhältnis von Transkripten zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach dem Übergang von hoch- (5%) zu niedrig- (0.037%) CO2 erfasst werden. Unter den Genen, die bei hoch- bzw. niedrig- CO2 Bedingungen unterschiedlich reguliert sind, wurden auch einige für CCM-Kandidaten identifiziert, wie Rubisco-Activase (der Einbau des markierten Proteins in isolierte Zentralkörper konnte durch import in isolierte cyanellen und ausschließende Fraktionierung nachgewiesen werden) und ein putativer Bicarbonat-Transporter, bis dato der einzige in Frage kommende Ci-Transporter (Ci, anorganischer Kohlenstoff). Ein weiterer Forschungsschwerpunkt war die Charakterisierung der Gene für Carbo-Anhydrase (CA): eine putative cytosolische CA und zwei Isoformen einer putativen mitochondrialen CA wurden beschrieben. Die dargelegten Befunde unterstützen die Existenz eines CCM in C. paradoxa, jedoch bedarf es weiterer Ergebnisse um unsere Hypothese von „eukaryotischen Carboxysomen“ bestätigen oder verwerfen zu können. Ein wichtiges Teilprojekt war die Etablierung der ELMI, auch in Hinblick auf künftige Immuno-EM. Leichte Unterschiede in Größe und Morphologie der Carboxysomen wurden beobachtet. Die Carboxysomenpräparation wurde ebenfalls untersucht. Hinweis auf quasikristalline Arrays aus Rubisco-Molekülen (L8S8), ähnlich wie in Cyanobakterien, wurden erhalten. Die zahlreichen Aufnahmen erbrachten den eindeutiger Nachweis daß das Cyanellen-Mikrokompartment während der Teilung bestehen bleibt und durch das Septum in zwei Hälften getrennt wird. Weiters kann jetzt mit Sicherheit behauptet werden, daß nie Thylakoidmembranen durch den Zentralkörper gehen.

Abstract

(Englisch)

Aquatic microorganisms contribute approximately 50% to the total CO2 fixation in the biosphere (Behrenfeld et al., 2001). Among them, first the cyanobacteria and then, after the endosymbiotic event, cyanobacteria and algae together have been responsible for creating the present atmosphere of 21% oxygen. Furthermore, all cyanobacteria investigated and most algae developed similar solutions to cope with the low CO2 content (0.037%; Keeling and Whorf, 2004) of the atmosphere and their dependence on diffusive entry of CO2 by evolving CO2 concentration mechanisms (CCM) different from those emerging later in C4 and CAM plants. However, the type of the CCM microcompartment harboring Rubisco is different in prokaryotic and eukaryotic oxygenic phototrophic microorganisms: carboxysomes and pyrenoids, respectively. Carboxysomes could have been transferred via endosymbiosis and then changed to pyrenoids in algae or, alternatively, carboxysomes and pyrenoids arose independently (Badger et al., 2006; Giordano et al., 2005). Each cyanelle is surrounded by two envelope membranes, their thylakoids are peripheral and concentrically arranged, between them intrathylakoidal phycobilisomes are present.The centre of the cyanelles of Cyanophora is occupied by a large electron dense roundish sometimes polyhedral body, which has been shown, by protein A-gold immuno electron microscopy, to contain the bulk of ribulose- l,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (Mangeney and Gibbs, 1987). Phosphoribulose kinase which catalyzes the regeneration of ribulose-l,5-bisphosphate from ribulose-5-phosphate is localized outside the carboxysome, in the thylakoid region (Mangeney et al., 1987). Carboxysomes of cyanelles and of cyanobacteria thus resemble pyrenoids in eukaryotic algae. Cyanophora paradoxa, the best-investigated alga of the Glaucocystophyta, contains plastids (cyanelles) surrounded by a prokaryote-type peptidoglycan wall, which represent a very early stage in organelle evolution. The unusual plastids of C. paradoxa display several cyanobacterial features besides the peptidoglycan wall. Therefore, our assumption is that the glaucocystophyte cyanelles bear a cyanobacterial central body for acclimation to low [CO2] by virtue of a cyanobacterial CCM. The characterization of the central body of C. paradoxa and its CCM as well as the identification of homologues of cyanobacterial and algal proteins involved in carboxysome and/or pyrenoid biogenesis and functioning were the goals. An isolation procedure for central bodies was developed to be able to perform mass spectrometry on in-gel digested bands of SDS-PAGE gels. Two cDNA libraries, for conditions of low- and high [CO2], were constructed. At the University of Illinois, high-throughput sequencing of 4992 clones generated a collection of expressed sequence tags (ESTs). Genes involved in the CCM were among the abundant transcripts (shown by S. Burey). Through a different collaboration, phylogenetic analyses using EST data from C. paradoxa provided further evidence for the monophyletic origin of the kingdom plantae. A subset of largely unique ESTs was PCR-amplified and PCR products spotted on coated slides for microarray analysis of transcript levels at various timepoints after shift from high (5%) to low- (ambient, 0.037%) CO2. Among the genes showing differential regulation upon high- and low- CO2 a number of CCM candidate genes were identified, such as Rubisco activase and a putative bicarbonate transporter - to date the only Ci transporter (Ci, inorganic carbon) candidate in C. paradoxa. Emphasis was placed on identifying various carbonic anhydrases (CA): a putatively cytosolic CA and two isoforms of putatively mitochondrial CA were described. The results presented support the existence of a CCM in C. paradoxa, though more data is required to support or refute our hypothesis of "eukaryotic carboxysomes". The morphology and size of the central bodies were compared for high and low CO2 cells using a JEOL 1210 transmission electron microscope (collaboration with Dr. Siegfried Reipert from Department of Molecular Cell Biology). High pressure cryofixation (Empact HP-freezer, LEICA Microsystems) in Combination with freeze substitution (AFS, LEICA Microsystems) were employed to preserve both the fine structural details. Peptide pattern and sequence information for components of isolated central bodies smaller than 57 kDa were obtained after in-gel protease digestion bands via MALDI-TOF- and nanoelectrospray tandem mass spectrometry, respectively (collaboration with Günter Allmaier and Martina Marchetti, Technical University of Vienna). Rubisco activase was identified as a bona fide componend of the central body. In vitro assembly of this chaperone together with Rubisco could be show after import of labeled precursor into isolated cyanelles and subsequent fractionation.

Autor*innen

Sara Fathinejad

Haupttitel (Englisch)

The central body of the cyanelles of Cyanophora paradoxa

Hauptuntertitel (Englisch)

a eukaryotic carboxysome?

Paralleltitel (Deutsch)

Der Zentralkörper der Cyanellen von Cyanophora paradoxa ; ein eukaryontisches Carboxysom?

Publikationsjahr

2008

Umfangsangabe

123 S.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Fritz Pittner ,

Hideya Fukuzawa

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC05036688

Utheses ID

300

Studienkennzahl

UA | 091 | 490 | |

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