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Localization of the human neonatal Fc receptor (hFcRn) in the syncytiotrophoblast and fetal endothelial cells of human term placental chorionic villi "in situ" and in isolated human placental endothelia cells "in vitro"

Yuliya Mytsko

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Isabella Ellinger

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DOI

10.25365/thesis.33792

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-30424.44046.141759-6

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Das Immunsystem menschlicher Föten und Neugeborener ist unreif und während der ersten Lebensmonate sind Babies nicht in der Lage genügend Antikörper zum Schutz vor Infektionen zu produzieren. Vorsorglich erhalten Föten daher bereits während der Schwangerschaft eine natürliche passive Immunisierung mit mütterlichen Immunglobulinen der Klasse G (IgGs). Maternales IgG wird dabei in einem Rezeptor-mediierten Prozess über die Plazenta zum Föten transportiert. Der IgG-Transfer erfolgt hauptsächlich in der reifen menschlichen Plazenta, in der die Plazentaschranke aus zwei Zellschichten besteht. Einerseits dem multinukleären epithelialen Synzytiotrophoblast (STB) und andererseits den fötalen Endothelzellen (FEC) der fötalen Kapillaren. Funktionelle Studien zeigten, dass der MHC Klasse I-homologe humane neonatale Fc-Rezeptor (hFcRn) in den transplazentaren IgG Transport involviert ist. hFcRn besteht aus zwei Untereinheiten, einer Membran-verankerten α-Kette und einem löslichen Protein, ß2-Mikroglobulin. Während viele Studien bestätigen, dass hFcRn in die IgG Transzytose durch den STB involviert ist, ist die Identität des Rezeptors, welcher IgG über die FECs transportiert nicht geklärt. Dies liegt an der widersprüchlichen Datenlage hinsichtlich hFcRn Expression in FEC in situ einerseits und in isolierten und in vitro kultivierten FECs andererseits. hFcRn Expression und die Involvierung von hFcRn in die IgG Transzytose in isolierten plazentaren FECs wurde gezeigt, dagegen konnte die hFcRn Expression in FECs in der terminalen Plazentaschranke in situ bisher nicht beschrieben werden. Stattdessen wurde ein anderer Fc-Rezeptor, FcγRIIb2, in FECs in situ nachgewiesen und auch mit IgG in FECs ko-lokalisiert. Während also Befunde aus Studien mit isolierten plazentaren FECs die Beteiligung von hFcRn an der IgG Transzytose über die gesamte plazentare Barriere unterstützen, fehlt eine Bestätigung der hFcRn-Expression in FECs im Gewebsverband (in situ). In dieser Arbeit wurde die Expression und Lokalisation der hFcRn α-Kette sowohl im reifen plazentaren Gewebe wie auch in daraus isolierten und kultivierten humanen plazentaren FECs unter Verwendung von Immunfluoreszenz Mikroskopie, Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), und Western Blotting untersucht. Die Proteinexpression wurde unter Verwendung eines spezifischen Affinitäts-gereinigten Kaninchen Antiserums, welches gegen eine Peptid-Sequenz der hFcRn α-Kette hergestellt worden war, untersucht. Zuerst wurde die Expression von hFcRn α-Kette in totalen plazentaren Gewebslysaten mittels Western Blotting bestätigt. Die Lokalisation der hFcRn α-Kette im plazentaren Gewebe in situ wurde danach mit Immunfluoreszenz Mikroskopie untersucht. Im Gegensatz zu publizierten Daten wurde die hFcRn α-Kette sowohl in STB (Zytokeratin 7 positiv) wie auch in FECs (CD31 positiv) nachgewiesen, wobei überraschenderweise FEC eine höhere Proteinexpression aufwiesen als STB. Dieses Expressionsmuster der hFcRn α-Kette wurde in allen untersuchten Plazentaproben beobachtet. In einer Zusammenarbeit mit der Medizinischen Universität Graz, wurden danach sowohl arterielle wie auch venöse FECs aus humanen reifen Plazenten isoliert. hFcRn α-Kette mRNA und Proteinexpression wurde per RT-PCR und Western Blotting in beiden Zelltypen bestätigt. Wie mit Immunfluoreszenzmikroskopie dargestellt wurde, internalisierten die kultivierten, CD31 positiven FECs IgG und die hFcRn α-Kette lokalisierte vor allem in intrazellulären Kompartimenten. Eine endosomale Lokalisation von hFcRn, wie sie auch in Trophoblasten-artigen BeWo Zellen beobachtet wurde, entspricht der hFcRn Funktion, da dieser IgG hauptsächlich in diesen angesäuerten intrazellulären Organellen bindet. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass in dieser Studie erstmals die Expression der hFcRn α-Kette in beiden Zellschichten (STB, FEC) der reifen humanen Plazentabarriere in situ dargestellt wurde und die FEC-Expression in isolierten und in vitro kultivierten FECs bestätigt werden konnte. Diese Lokalisation des Rezeptors in sowohl STB wie auch FECs unterstützt das Konzept, dass hFcRn die IgG-Transzytose über die gesamte Plazentaschranke mediiert. Da jedoch auch die Expression von hFcγRIIb2 in FECs in situ und in vitro bestätigt wurde, müssen zukünftige Studien die individuelle Beteiligung von hFcRn und hFcγRIIb2 am IgG Transport über FECs untersuchen.

Abstract

(Englisch)

The immune system of the human fetus and newborn is immature and during the first month of life the baby is unable to produce the amount of antibodies needed for protection from infections and toxins. Therefore, already during pregnancy a passive immune-protection is provided by active transport of maternal IgG across the placental barrier. In the full term placenta, where the major transfer of IgG occurs, the placental barrier consists of two cell layers, the multinucleated epithelial syncytiotrophoblast (STB) and fetal endothelial cells (FEC) of the fetal capillaries. Transplacental IgG transfer clearly involves the MHC class I-like human neonatal Fc-receptor, hFcRn, composed of a transmembrane α-chain and soluble ß2-microglobulin. It is well established that transcytosis across the STB is mediated by hFcRn, but the identity of the receptor involved in IgG-transport across the FEC remains unclear due to contradictory data on hFcRn expression in the FEC in situ and isolated and in vitro cultured FECs. While in isolated FECs, expression and involvement of hFcRn in IgG-transcytosis were demonstrated, hFcRn expression in FECs in terminal villi in situ was not described. In contrast, FECs in situ were shown to express another Fc-receptor, FcγRIIb2, which was co-localized with IgG in intracellular vesicles of FECs. Thus, while in vitro data support the involvement of the hFcRn in IgG transcytosis across the entire placental barrier, in situ expression of hFcRn in FECs remains to be unequivocally demonstrated. In this work, expression of hFcRn α-chain was re-investigated both in term placental chorionic tissue samples as well as in isolated and cultured human placental FECs using Immunofluorescence Microscopy, Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), and Western Blotting. Protein expression was analyzed using a specific affinity-purified rabbit antiserum previously prepared against a peptide-sequence of hFcRn α-chain. First, expression of hFcRn α-chain in total placental tissue lysates was confirmed by Western Blotting. Localization of hFcRn α-chain in placental tissue in situ was then re-investigated by Immunofluorescence Microscopy. In contrast to the published data both the STB (Cytokeratin 7 positive) and FECs (CD31 positive), were found to express hFcRn α-chain, and surprisingly, higher expression of the protein in the FEC as compared to the STB was found. This pattern of hFcRn α-chain expression was observed in all placentas investigated. In collaboration with the Medical University of Graz, arterial and venous FECs were then isolated from human term placentas, and hFcRn α-chain mRNA and protein expression in both cell types was confirmed by RT-PCR and Western Blotting, respectively. As analyzed by Immunofluorescence Microscopy, cultured FECs (CD31 positive) were able to internalize IgG and exhibited a predominant intracellular localization of hFcRn α-chain. A predominant endosome localization of hFcRn, which is also observed in the trophoblast-like BeWo cell line, is in line with hFcRn function, which binds IgG predominantly in these acidic organelles. In conclusion, this study demonstrated for the first time expression of hFcRn α-chain in both cell layers (STB, FEC) of the term human placental barrier in situ and confirmed FEC- expression in isolated and in vitro cultured FECs. Presence of the receptor in STB and FECs suggests that hFcRn mediates IgG-transcytosis across the entire placental barrier. As expression of hFcγRIIb2 was also observed in FECs in situ and in vitro, future studies need to clarify the individual contributions of hFcRn and hFcγRIIb2 in IgG transport by FECs.

Autor*innen

Yuliya Mytsko

Haupttitel (Englisch)

Paralleltitel (Deutsch)

Lokalisierung von menschlichen neonatalen Fc-Rezeptor (hFcRn) in Synzytiotrophoblasten und fetalen Endothelzellen der menschlichen plazentaren Chorionzotten in situ und in isolierten HPEC in vitro

Paralleltitel (Englisch)

Localization of the human neonatal Fc receptor (hFcRn) in the syncytiotrophoblast and fetal endothelial cells of human term placental chorionic villi in situ and in isolated human placental endothelia

Publikationsjahr

2014

Umfangsangabe

105 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Isabella Ellinger

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC12140552

Utheses ID

30005

Studienkennzahl

UA | 066 | 834 | |

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