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Exploring the molecular basis for different EB1 interaction networks in budding yeast
Josef Fischböck
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Stefan Westermann
DOI
10.25365/thesis.33873
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30062.28477.493569-9
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Mikrotubuli sind essentiell für viele Prozesse in der Zelle, z.B. der akkuraten Aufteilung von Chromosomen, wo Fehler zu ernsthaften Krankheiten wie Krebs führen können. Sie sind intrinsisch polare, höchst dynamische, zylindrische Polymere, welche aus α und β Tubulin zusammengesetzt sind. Während die plus Enden dynamisch sind und zwischen Wachstums-Perioden und Depolymerisation wechseln, sind die Minus Enden bevorzugt verankert an den Zentrosomen. Die Dynamik von Mikrotubili ist in lebenden Organismen durch Mikrotubuli assoziierte Proteine (MAPs) reguliert. Mutationen in Genen, die für diese Klasse von Proteinen codieren, können zu Defekten in der Entwicklung der Großhirnrinde führen. Eine Untergruppe von MAPs sind die +TIPs, welche aktiv am plus Ende von Mikrotubuli lokalisiert sind, was sie in eine perfekte Position bringt, um sowohl die Dynamik von Mikrotubuli als auch deren Befestigung an zelluläre Strukturen wie die Zellwand, Kinetochore, endoplasmatisches Retikulum zu kontrollieren. In den letzten Jahren verdeutlichten sich die Anzeichen, dass Proteine der EB-Familie eine zentrale Rolle in der Etablierung von Proteinnetzwerken an den Mikrotubul Plus Enden einnehmen, in dem sie andere +TIPs dort hin rekrutieren. EB Proteine besitzen eine EBH Domäne, durch welche sie mit Proteinen, welche ein SxIP (Serin – beliebige Aminosäure –Iisoleucin – Prolin) Motiv besitzen, Bindungen eingehen können. Zusätzlich können EB Proteine über ihren sauren/aromatischen C-Terminus mit den basischen Domänen in CAP-Gly Domänen enthaltenden Proteinen wie CLIP-170 und p150glued/Dynactin interagieren. EB Proteine sind hoch konserviert und wohingegen in Säugern drei Mitglieder der EB Familie existieren (EB1, EB2 und EB3), gibt es in dem simplen Modellorganismus Hefe nur ein Homolog namens Bim1. In dieser Arbeit untersuchte ich die molekulare Grundlage für verschiedene, auf EB1 basierende Interaktions-Netzwerke durch Verwendung von Hefe, welche die kombinierte Anwendung genetischer, biochemischer und zellbiologischer Methoden ermöglicht. Ich generierte Mutanten, die die Interaktion mit Proteinen, welche SxIP Motive und/oder CAP-Gly Domänen enthalten, verhindern. Durch den Einsatz von „Pull-down“ Experimenten gefolgt von Massenspektrometrie wurde die Komposition von Proteinen, die mit diesen Bim1 Mutanten assoziieren, bestimmt.
Die Bim1 Mutante in der beide Domänen mutiert waren, ermöglichte es die spezifischen Effekte von Bim1, unfähig mit Bindungspartnern zu interagieren, auf die Regulation des Mikrotubuli Zytoskeletts zu untersuchen. Der Phänotyp dieser Mutante wurde durch Mikroskopie an lebenden Zellen und Viabilitätstests determiniert. Dadurch konnte ich zeigen, dass eine Bim1 Mutante, die nichtmehr mit ihren Bindungspartnern interagiert, ähnliche Phänotypen (Wachstums Defekte, Miss-Orientierung der Spindel) hat wie ein Stamm, in dem Bim1 deletiert ist.
Zusätzlich dazu identifizierte ich Ase1, das PRC1 Homolog, welches antiparallele Mikrotubuli bündelt, als neuen Bim1 Interaktionspartner und charakterisiere die Bindung zwischen den beiden durch eine Kombination von biochemischen und auf Mikroskopie basierten Methoden. Damit konnte ich zeigen, dass in lebenden Organismen der N-Terminus von Ase1 und die EBH Domäne von Bim1 für die Interaktion zwischen den beiden benötigt werden.
Abstract
(Englisch)
Microtubules are central to many essential processes in cells, such as accurate chromosome segregation, where alterations can lead to severe diseases like cancer. They are intrinsically polar, highly dynamic, cylindrical polymers of α/β-tubulin heterodimers. While the plus ends are the dynamic ends of microtubules that switch between periods of growth and shrinkage, the minus ends are preferably anchored at the centrosomes and have a much lower net exchange rate of tubulin dimers. In vivo, microtubule dynamics are regulated by microtubule-associated proteins (MAPs). Mutations in genes, encoding for this class of proteins, can cause defects in the development of the cerebral cortex. A subgroup of MAPs, the plus-end tracking proteins (+TIPs), actively remain at growing microtubule plus ends. They are not only perfectly positioned to control microtubule dynamics, but they also serve as a link between the microtubule network and cellular structures (i.e. cell cortex, kinetochores, endoplasmatic reticulum).
In the recent years the End Binding (EB) protein family has emerged as central adaptors of microtubule tip associated networks, as EBs can recruit other +TIPs to growing microtubule ends. EB proteins contain an EB homology (EBH) domain, which allows them to interact with SxIP (serine – any amino acid – isoleucine – proline) motif containing proteins. In addition, EB proteins can interact via their acidic/aromatic C-terminus with the basic groove of CAP-Gly domain containing proteins, such as CLIP-170 and p150glued/dynactin. EB proteins are highly conserved and whereas mammals contain three EB family members (EB1, EB2 and EB3) in the simple model organism Saccharomyces cerevisiae (budding yeast) there is only one homologue called Bim1. Here I investigated the molecular basis for different EB1-based interaction networks by using budding yeast, which is highly amenable to the combined application of genetic, biochemical and cell biological studies.
I generated mutants abrogating the interaction with SxIP motif and/or CAP-Gly domain containing proteins. By performing pull-down assays followed by mass spectrometry the composition of +TIPs associated with these Bim1 mutants was determined.
The Bim1 mutant that had both interaction domains mutated simultaneously, allowed me to dissect the specific roles of Bim1, unable to bind any partners, on the regulation of the microtubule cytoskeleton. The phenotypes of the mutant strains were determined by live cell imaging of fluorescently tagged proteins using Deltavision Deconvolution Microscopy and by performing benomyl spot assays. These experiments clearly demonstrated that the Bim1 mutant, unable to bind to interaction partners, phenocopies a Bim1 deletion strain (growth defects, spindle misorientation, “spindle rocking”).
In addition to that, I identified the PRC1 homologue Ase1, which bundles antiparallel microtubules, as a novel binding partner of Bim1 and I further characterized this interaction by performing a combination of biochemical and microscopy-based assays. I could show that in vivo the interaction between Ase1 and Bim1 depends on the N-terminal part of Ase1 and the EBH domain of Bim1.
Autor*innen
Josef Fischböck
Haupttitel (Englisch)
Exploring the molecular basis for different EB1 interaction networks in budding yeast
Paralleltitel (Deutsch)
Erforschung der molekularen Grundlagen für verschiedene EB1 Interaktionsnetzwerke
Paralleltitel (Englisch)
Exploring the molecular basis for different EB1 interaction networks in budding yeast
Publikationsjahr
2014
Umfangsangabe
66 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Stefan Westermann
Klassifikation
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines
AC Nummer
AC12143133
Utheses ID
30070
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |