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Structural studies on calcium regulation of α-actinin
Eirini Gkougkoulia
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Kristina Djinovic-Carugo
DOI
10.25365/thesis.34113
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29576.72966.204960-7
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
α-Actinin spielt eine Schlüsselrolle unter den Actin-bindenden Proteinen (ABPs).
Es verbindet Actinfilamente durch Quervernetzung, zählt zur Spektrin-Familie und
liegt auf molekularer Ebene als anti-paralleles Dimer vor. Jede seiner Untereinheiten
bestehen aus der Actin-bindenden Domäne (ABD) am N-Terminus, gefolgt von
einer “neck”-Region und einer langgestreckten, zentralen Rod-Domäne aus vier
Spektrin-Repeats (SRs). Am C-Terminus befindet sich die Calcium-bindende Region
(Calmodulin (CALcium-MODULated proteIN)-artige Domäne) bestehend aus zwei
Paaren des EF-Hand-Motivs.
α-Actinine haben auf Grund ihrer Assoziation mit Erkrankungen während der
letzten Jahre großes Interesse auf sich gezogen. Genauere Kenntnisse über ihre
Regulation könnte einige Antworten offenlegen. Die Calcium-Regulation von α-
Actinin ist eine von vier grundlegenden Regulationsmechanismen, und trotz einer
Fülle an biochemischen Daten ist nur sehr wenig über die physiologische Funktion
und ihren Mechanismus bekannt. Das Verständnis über Details des Mechanismus war
lange Zeit dadurch erschwert, dass die Struktur des Calcium-sensitiven α-Actinins
nicht in voller Länge bekannt war.
Als ein sehr passendes Modell für strukturelle und funktionelle Studien diente
die Isoform 2 der Entamoeba histolytica (zu 30 % ident mit der menschlichen Nicht-
Muskel-Isoform) als Archetyp eines Ur-α-Actinin-Moleküls. Es besteht aus zwei
Calcium-sensitiven Spektrin-Repeats, die ähnlich den SR1 und SR4 des menschlichen
Homologs sind.
In dieser Dissertation wird zum ersten Mal die Struktur der Isoform 2 von α-Actinin
der Entamoeba histolytica in Gegenwart von Calcium in atomarer Auflösung präsen-
tiert. Außerdem wurden Calcium-insensitive Mutanten konstruiert und kristallisiert,
um den Einfluss von Calcium auf die Proteinstruktur zu untersuchen. Mit SEC,
DSF, co-sedimentation assays, negative staining EM und SAXS wurden weitere bio-
physikalische und Strukturanalysen durchgeführt. Weiters wurde auch eine verkürzte
Isoform 1 des menschlichen α-Actinins konstruiert und kristallisiert.
Die Kombination aus den erwähnten biochemischen Ergebnissen und den Struk-
turanalysen deutet darauf hin, dass das Protein unter Calcium-Bindung wegen der
Bindung des Halses an EF-Hand 3–4 und der Einschiebung einer Helix von EF-
Hand 1 zwischen SR1 der einen Untereinheit und SR2 der anderen Untereinheit
eine kompaktere, sichelähnliche Form annimmt, die die Interaktion mit F-Actinin
beeinträchtigt. Im Gegensatz dazu ist in Abwesenheit von Calcium der ungebundene
Hals flexibel, und die ABD bis zur Bindung an F-Actin frei.
Die vorliegende Arbeit eröffnet neue Möglichkeiten zur Untersuchung der Funktion
und Interaktion des Calcium-sensitiven α-Actinins und in weiterer Folge der damit
assoziierten Erkrankungen.
Abstract
(Englisch)
One of the key-role player actin-binding proteins (ABPs) is α-actinin, which crosslinks
actin filaments. It is a member of the spectrin family and at molecular level α-actinin
is an anti-parallel dimer. Each subunit consists of an actin-binding domain (ABD)
at the N-terminus, followed by the “neck” region and an elongated central rod
domain of four spectrin-like repeats (SRs). At the C-terminus, there is the CALcium
MODULated proteIN, Calmodulin (CaM)-like domain composed of two pairs of
EF-hand motif.
α-Actinins have attracted great interest during the last few years because of their
association with human diseases. A closer look at how they are regulated may provide
some answers. Calcium regulation of α-actinin is one of the four basic regulations,
and despite of the large amount of biochemical data, very little is known about its
actual physiological function and its mechanism. Understanding the details of the
mechanism of calcium regulation has long been hampered, because until now there
was no structure revealed of the full length of the calcium sensitive α-actinin.
A very suitable model for structural and functional studies is provided by the
isoform 2 from Entamoeba histolytica (30 % identity with the human non-muscle
isoform) as an archetype of an ancestral α-actinin molecule. It comprises two SRs,
well conserved and similar to the SR1 and SR4 from human homologues, and it
exhibits calcium sensitivity.
Here, for the first time, the atomic resolution structure of isoform 2 α-actinin
from E. histolytica in the presence of calcium is presented. Additionally, in order
to investigate the influence of calcium on the protein structure, calcium insensitive
mutants were designed, produced and crystallized. Further biophysical and structural
measurements were conducted using analytical size exclusion chromatography (SEC),
differential scanning fluorimetry (DSF), co-sedimentation assays, negative staining
electron microscopy (EM) and small-angle X-ray scattering (SAXS). At the same
time, a new truncated version of the human isoform 1 α-actinin was designed, purified
and crystallized, as well.
The combination of the biochemical findings mentioned above and structural
analysis suggests that upon calcium binding, the protein is more compact because of
the bound neck to EF-hands 3–4, and the intercalation of one helix of EF-hand 1
between SR1 of one subunit and SR2 of the other subunit. This stiff structure results
in a “sickle” shape, which impairs the interaction with actin filaments (F-actin). In
contrast, in absence of calcium, the unbound neck is unstructured and flexible by
providing freedom to the ABD, until it anchors to F-actin.
This work opens up new possibilities for studying the function and the interaction
of the calcium sensitive α-actinin and consequently further study of the respective
human diseases.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
alpha-Actinin calcium-regulation Entamoeba histolytica Structural Biology Crystallography
Schlagwörter
(Deutsch)
alpha-Actinin Calcium-Regulation Entamoeba histolytica Strukturbiologie Kristallographie
Autor*innen
Eirini Gkougkoulia
Haupttitel (Englisch)
Structural studies on calcium regulation of α-actinin
Paralleltitel (Deutsch)
Strukturanalysen der Calcium-Regulation von alpha-Actinin
Publikationsjahr
2014
Umfangsangabe
XX, 121 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Robert Konrat ,
Jari Ylänne
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC12088203
Utheses ID
30282
Studienkennzahl
UA | 094 | 490 | |