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Optimising preparation of intestinal mucosal tissue and intestinal contents to study effects of "Akkermansia spp." supplementation during dextran sulfate sodium-induced colitis in mice
Felicitas Dötzl
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Alexander Loy
DOI
10.25365/thesis.34184
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30250.57988.554762-7
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Der Gastrointestinaltrakt enthält 1012 bis 1014 Bakterien. Es wird angenommen, dass allein im Dickdarm 70 % aller im humanen Körper enthaltenen Mikroben gefunden werden können. Eine Störung dieser Darmflora wurde mit chronisch entzündlichen Darmkrankheiten, wie Morbus Crohn oder Colitis ulcerosa in Zusammenhang gebracht. Als solche Veränderung der Darmflora wird die Verminderung der Anzahl an mucusabbauenden Akkermansia muciniphila gehandelt. Deshalb wird angenommen, dass eine Supplementierung von probiotischen Akkermansia spp. positive Auswirkungen auf eine Natrium-Dextransulfat (DSS)-induzierte Colitis hat. Das Projektteam hat beobachtet, dass die Supplementierung von C57BL/6 WT Mäusen mit lebensfähigen humanen H2- und MucT-Akkermansia zu einem starken Gewichtsverlust in den ersten Tagen führte, wobei diese Mäuse vier Tage nach Beginn der Verabreichung, als Akkermansia-DNA auch in einer quantitative PCR nachweisbar war, wieder an Gewicht zunahmen. Hitzeinaktivierte (HI) und lebensfähige Akkermansia des MG-(Maus)-Stammes, sowie alle anderen HI-Stämme hatten im Vergleich zur Kontrollgruppe keine positiven oder negativen Auswirkungen auf das durchschnittliche Gewicht, weder vor, noch während der DSS-induzierten Entzündung. Bei der Evaluierung von Dickdarmgewebedünnschnitten mittels Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) konnte die Rekolonisierung des Dickdarms durch Akkermansia spp. in allen Gruppen, außer in der Kontrollgruppe, nachgewiesen werden. Allerdings wurde kein relevanter Zusammenhang zwischen der Anwesenheit von Akkermansia spp. und dem Entzündungsgrad nachgewiesen. Darüber hinaus konnten die mucinabbauenden Bakterien nicht, wie erwartet, ausschließlich an der intestinalen Mucusschicht nachgewiesen werden, sondern diese verteilten sich über das gesamte Darmlumen.
Für eine bessere Bewertung des Zusammenhangs zwischen der Anwesenheit von Akkermansia spp. im Dickdarm und der Störung der Darmschleimhaut ist eine Kombinationsfärbung von beiden notwendig. Der Hauptbestandteil von Mucus ist Wasser (> 98 %), dadurch ist eine Visualisierung mittels Mikroskop schwierig. Neun verschiedene Fixiermittel und unterschiedliche Färbemethoden wurden getestet, um die besten Bedingungen für die optimale Gewebe- und Schleimhauterhaltung, sowie gute Signalintensität mittels FISH zu finden. FISH wurde auf fixiertem Blinddarminhalt mit der allgemeinen Sonde EUBmix I – III und den spezifischen Sonden für Bacteroidales und Clostridium clusters XIVa und XIVb durchgeführt. Mittels DAIME wurde deren Average Volume Fraction und Signalintensitäten ermittelt. Auf Signalintensität und Strukturerhaltung während einer Alzianblaufärbung bezogen, lieferten Fixierung mit 4 % PFA, 6/3/1 wasserfreiem EtOH-Carnoy und 6/6/1 MetOH-Carnoy die besten Ergebnisse. Da die Färbung der Darmschleimhaut mit Alzianblau aber nicht mit FISH kombinierbar ist, wurden immunhistochemische Färbemethoden mit dem Lektin Jacalin aus der Jackbaumfrucht und mit dem mucinspezifischen Anti-MUC2-Antikörper getestet. Die Lektinmarkierung lieferte keine klare Färbung der intestinalen Mucusschicht, die Antikörpermarkierung von MUC2 hingegen führte zu einer eindeutigen Färbung der Mucusbarriere, des Bürstensaums und der Becherzellen. Um symbiotische Bakterien zu lokalisieren, konnten durch die Kombination von MUC2-Antikörperfärbung und FISH keine zufriedenstellenden Signalintensitäten der Sonden erzielt werden.
Abstract
(Englisch)
The gastrointestinal tract is filled with 1012 to 1014 bacteria, and it is assumed that the colon alone harbours over 70 % of the total number of microbes found in the human body. A disturbance of the gut microbiota has been associated with inflammatory bowel diseases, such as Crohn’s disease or ulcerative colitis. The depletion of Akkermansia muciniphila, a known mucin degrader, is thought to be such an alteration of the gut community. Because of this, supplementation of probiotic Akkermansia spp. is thought to have a positive effect on colonic inflammation during dextran sulphate sodium (DSS)-induced colitis. We observed that supplementation of C57BL/6 WT mice with viable H2- and MucT-Akkermansia (human isolates) caused a strong weight loss in the first days of supplementation whereas mice re-gained weight after four days of administration, when H2- and MucT-Akkermansia-DNA was also detectable by qPCR. Heat inactivated (HI) and viable Akkermansia of the MG (mouse isolate) strain, as well as all other HI strains did not show any positive or negative effects on the average weight compared to the control group - neither before, nor during DSS-induced colitic inflammation. Evaluation of colonic sections with fluorescence in situ hybridisation (FISH) revealed the re-colonisation of Akkermansia spp. in all of the groups, except of the control group, but no significant correlation between inflammation scoring and the presence of Akkermansia spp. could be observed. Furthermore, the mucin degrading bacteria were not as expected localised exclusively next to the intestinal mucosal barrier, but distributed across the whole lumen.
Nevertheless, for better evaluation of relations between the presence of Akkermansia spp. in the colon and the disruption of the mucosal barrier a combined staining of both is necessary. As the main component of mucus is water (> 98 %), it is challenging to visualize it microscopically. Nine different fixatives and different staining methods were tested to find conditions for optimal tissue and mucosal preservation, as well as high signal intensities during FISH. FISH was performed on fixed cecum content samples using the general bacterial EUB338 I – III probe mix, and specific probes for the detection of Bacteroidales and Clostridium clusters XIVa and XIVb, which were determined for their average volume fraction and the probe signal intensity using DAIME. Fixation with 4 % PFA, 6/3/1 anhydrous EtOH-Carnoy, and 6/6/1 MetOH-Carnoy gave the best results concerning FISH probe signals and preservation of mucosal structures as determined during Alcian Blue staining. As Alcian Blue staining of mucin detection was not combinable with FISH, immunohistochemical staining with either the lectin Jacalin derived from Jackfruit seed, or the mucin specific anti-MUC2-antibody were performed. No clear mucin staining could be observed during lectin staining, but the antibody staining of MUC2 resulted in clear strong staining of the intestinal mucosal barrier, brush borders, and of goblet cells. Nevertheless, it was not possible to yield good probe signal intensity when the MUC2-antibody staining was combined with FISH to determine the localisation of commensal bacteria.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
gut microbiota Akkermansia muciniphila inflammatory bowel disease fluorescence in situ hybridisation mucus MUC2 Alcian Blue cell shedding
Schlagwörter
(Deutsch)
Darmflora Akkermansia muciniphila chronisch entzündliche Darmkrankheiten Fluoreszenz in situ Hybridisierung Mucus MUC2 Alzianblau Cell Shedding
Autor*innen
Felicitas Dötzl
Haupttitel (Englisch)
Optimising preparation of intestinal mucosal tissue and intestinal contents to study effects of "Akkermansia spp." supplementation during dextran sulfate sodium-induced colitis in mice
Paralleltitel (Deutsch)
Präparation von intestinalem mukosalem Gewebe und Darminhalt um Effekte einer zusätzlichen Gabe von "Akkermansia spp." während einer Natriumdextransulfat-induzierten Colitis in Mäusen zu untersuchen
Publikationsjahr
2014
Umfangsangabe
VIII, 99 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Alexander Loy
AC Nummer
AC12155894
Utheses ID
30346
Studienkennzahl
UA | 066 | 830 | |