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Investigating complex carbon degradation in a beech forest soil and first insights into the application of single-cell methods to detect active microorganisms in soil systems
Florian Strasser
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Michael Wagner
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Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
DOI
10.25365/thesis.34218
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29177.55421.683369-7
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Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Terrestrische Ökosysteme beherbergen einen Großteil des auf der Erde vorkommenden Kohlenstoffs (C). Totes Pflanzenmaterial, das hauptsächlich aus Zellulose besteht, ist die Hauptquelle dieses Kohlenstoffs. Bakterien und Pilze sind die Hauptakteure im Abbau dieses Kohlenstoffreservoires. Wir stellten die Hypothese auf, dass durch die Zugabe von unterschiedlichen C- und Stickstoff (N) quellen unterschiedliche mikrobielle Gruppen aktiv Zellulose abbauen. Wir verwendeten destruktiv beprobte Mikrokosmen, die mit 13C- markierter Zellulose und verschiedenen C- und N-Quellen versetzt wurden, um zellulolytische Aktivität zu messen und Zellulose abbauende mikrobielle Gruppen zu identifizieren. Während C-Zugaben generell die Atmungsaktivität (gemessen mittels 12CO2) steigerten, zeigten 13CO2 Messungen und Enzym-Assays, dass N-Zugaben gezielt den Zelluloseabbau förderten. Aktive Zellulose-abbauende mikrobielle Gruppen wurden durch 13C-PLFA-Analyse identifiziert. Die höheren Abbauaktivitäten in den N-Zugaben waren auch durch erhöhte 13C-PLFA Werte sichtbar. Die Zugabe von N führte zu einer Zunahme von Pilz-Markern im Gegensatz zur Zugabe von Glucose, welche zu einer höheren Abundanz der bakteriellen PLFA-Marker führte. Dies deutet darauf hin, dass der Zelluloseabbau durch diese mikrobiellen Gruppen unterschiedlich limitiert ist. In weiteren saisonalen Untersuchungen fanden wir heraus, dass die 13CO2 Werte im Sommer und Herbst nicht signifikant unterschiedlich waren, dass allerdings Enzymaktivitäten im Herbst niedriger waren als im Sommer. Um mikrobielle Aktivitäten feinauflösend untersuchen zu können ist die Analyse auf Einzelzell-Ebene unumgänglich. Hoch auflösende Sekundärionen Massenspektroskopie (NanoSIMS) und Raman Mikrospektroskopie sind neue Techniken mit denen es möglich ist einzelne mikrobielle Zellen zu untersuchen. In Kombination mit Stabilen-Isotopen-Tracern ist es möglich Aktivitäten einzelner Zellen zu messen. Aufgrund der Beschaffenheit von terrestrischen Ökosystemen wurden diese Techniken jedoch nur sehr begrenzt in diesen Ökosystemen eingesetzt, vor allem wegen dem hohen Hintergrund von organischen und anorganischen Bodenpartikeln. In dieser Arbeit konnten wir erfolgreich ein Zellextraktionsprotokoll in Verbindung mit Dichte-Zentrifugation anwenden und den Anteil von Bodenpartikel in unseren Proben stark reduzieren. Dies ermöglichte eine nachfolgende Analyse von Zellen mit NanoSIMS und Raman Mikrospektroskopie. Da nach der Dichte-Zentrifugation die Zellen auf Filtern konzentriert werden, wurden verschiedene Filtermaterialien auf ihre Verwendbarkeit für Messungen im NanoSIMS 7 untersucht. Salzkristalle können Raman- und NanoSIMS-Messungen beeinträchtigen- deswegen testeten wir unterschiedliche Konzentrationen einer Phosphat gebufferten Saline (PBS; 1x PBS bis ddH2O) für die Aufreinigung von mikrobiellen Zellen. Ziel war es, eine Konzentration zu finden die NanoSIMS Messungen zulässt und die auf der anderen Seite die Zellintegrität aufgrund osmotischer Unterschiede nicht beschädigt. Überraschenderweise zeigten Zellen die mit Wasser gewaschen wurden die stabilste Morphologie. In einer Machbarkeitsstudie demonstrierten wir, dass es möglich war, Mikroorganismen aus Bodenproben zu extrahieren und mittels NanoSIMS ihre 13C-Cellulose-Abbau- und 15N2-Fixierungsaktivität nachzuweisen. Die 15N-Anreicherung in diazotrophen Zellen reichte von 2 bis 27 atom% (C-primed) und die 13C-Anreicherung in Zellulose-abbauenden Zellen von 11 – 36 atom% (C- und N-primed). Das angewendete Zellextraktionsprotokoll konnte auch mit Raman Mikrospektroskopie verbunden werden. Es war jedoch nicht möglich, die Aufnahme von 13C in Zellen desselben Mikrokosmus durch den charakteristischen 13C-Phenylalanin-Peak im Zellspektrum nachzuweisen. Weitere Tests ergaben, dass Phenylalanin bevorzugt aus in der Umwelt vorhandenen Aminosäuren/Oligopeptide synthetisiert wird, anstatt es aus aufgenommenen C neu herzustellen. Dies erschwert die Anwendung von Raman Mikrospektroskopie zur Detektion von 13C angereicherte Zellen aus Umweltproben mittels des charakteristischen 13C-Phenylalanin-Peaks.
Abstract
(Englisch)
Mineral soils encompass the largest pool of carbon (C) on Earth. Source of a major part of this C is cellulose from plants. Major participants in recycling plant derived C are microorganisms. However, it is unclear if there is a differential response across different microbial groups. We hypothesized that by varying certain limiting edaphic background properties that can limit cellulose degradation (such as C and Nitrogen (N)) we would identify different groups of microorganisms that respond to the addition of cellulose. We used destructively sampled soil microcosms amended with 13C uniformly labeled (UL) cellulose to identify cellulolytic microorganisms that respond to different types of background C and N in soil over a period of 25 days. Cellulose degradation was monitored using enzyme assays, CO2 measurements and PLFA analysis. The C-primed microcosms exhibited the highest overall respiration activity as measured by evolved 12CO2, whereas the N amended microcosms exhibited the highest activity of cellulose degradation, as measured by 13CO2 evolution. Furthermore the addition of N significantly increased extracellular cellulolytic as well as hemi-cellulolytic enzyme activities. Using 13C-PLFA analysis we quantitatively identified active microbial groups. N addition harbored the highest PLFA derived 13C with a community shift towards fungi as compared to the starting soil. In contrast, simple C led to a shift towards bacteria, suggesting different nutrient limitations of these groups concerning cellulose degradation. Furthermore we compared cellulose degradation between summer and fall using extracellular enzyme assays and CO2 measurements. Interestingly, respired 13CO2 yields did not differ between the two seasons whereas enzyme activities across all additions were lower in fall. Single-cell techniques such as high-resolution secondary ion mass spectroscopy (NanoSIMS) and Raman microspectroscopy are new and emerging techniques used to gain insights into activities of single microbial cells. To ascertain single-cell activities, these methods are often applied in combination with stable isotope tracer incubations. The application of these techniques however proves to be particularly challenging in terrestrial ecosystems due to the large background of organic and inorganic soil particles. In this thesis we successfully enhanced cell removal treatments in combination with density gradient to generate a cell fraction with reduced soil particle load and particles of small enough size to allow single-cell analysis by NanoSIMS or Raman microspectroscopy. For analysis cells have to be concentrated onto filters after density 5 centrifugation, thus different filter materials were investigated for their applicability in NanoSIMS analysis. As salt crystals interfere with both single-cell methods but especially NanoSIMS, washing with phosphate buffered saline (PBS) of different ionic strength was tested (1x PBS to pure ddH2O water) hoping to identify a dilution that would permit NanoSIMS investigations but also preserve the cell morphology. In conclusion, cells washed with water exhibited the most integer morphology than cells washed with dilutions of PBS and also provided the cleanest sample. The optimized cell concentration protocol allows single-cell analysis by NanoSIMS or Raman microspectroscopy. As a proof-of-concept, we were able to successfully apply the cell extraction method to detect 15N2-fixing and 13C-cellulose-degrading microorganisms in soil microcosms by NanoSIMS. The 15N-enrichment of diazotrophic microorganisms ranged from 2 to 27 atom % (C primed), and the 13C-enrichment of cellulolytic cells from 11 to 36 atom % (C or N primed). The developed method was also suitable for single-cell Raman microspectroscopy. However, we uncovered that the incubation of soil samples with 13C-carbon substrates not always generated the characteristic 13C-phenylalanine peak in Raman spectra of active microbes. Further analysis revealed that environmental amino acids or oligopeptides served as a source of unlabeled phenylalanine, thereby rendering this method for detecting 13C-enriched microorganisms in soil challenging.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
Cellulose Soil NanoSIMS Raman
Schlagwörter
(Deutsch)
Zellulose Boden NanoSIMS Raman
Autor*innen
Florian Strasser
Haupttitel (Englisch)
Investigating complex carbon degradation in a beech forest soil and first insights into the application of single-cell methods to detect active microorganisms in soil systems
Paralleltitel (Deutsch)
Untersuchungen des Abbaus komplexer Kohlenstoffquellen im Boden eines Buchenwaldes und erste Einblicke in die Anwendunf von Einzelzell-Methoden um aktive Boden-Mikroorganismen zu detektieren
Publikationsjahr
2014
Umfangsangabe
81 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Michael Wagner
Klassifikationen
42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie ,
42 Biologie > 42.91 Terrestrische Ökologie
AC Nummer
AC12159748
Utheses ID
30374
Studienkennzahl
UA | 066 | 830 | |
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