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Chemical derivatization and cellular imaging of immunosuppressive peptides

Mina Krasimirova Vasileva

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Gernot Schabbauer

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DOI

10.25365/thesis.34235

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29877.46362.762063-4

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Cyclotide wurden von den Pflanzen aus der Familien Rubiaceae, Violaceae und Cucurbiceae isoliert und bestehen aus zwischen 28 und 37 Aminosäuren was ein Molekulargewicht zwischen 2500 und 4000 Da entspricht. Sie sind cyclische Peptide, die eine charakteristische 3D Struktur besitzen, welche durch drei hoch konservierte Disulfidbrücken hervorgerufen wird. Sie wurden auch „cyclic cystine–knot (CCK)“ genannt. Dieses strukturelle Motiv ist verantwortlich für die besondere Stabilität und Widerstandsfähigkeit der Cyclotide zu einem thermischen, chemischen oder enzymatischen Abbau. Weiteres sind sie eher hydrophob wodurch sie an einer RP–HPLC Säule relativ spät eluieren. Vor mehr als 50 Jahre hat Sandberg berichtet, dass die afrikanischen Stämme ein Extrakt von der Pflanze Oldenlandia affinis verwendet haben, damit sie die Geburtswehen erleichtern. Später hat der norwegische Doktor Lorents Gran ethno botanische Untersuchungen gemacht und er hat entdeckt, dass der pflanzliche Extrakt cyclische Peptide enthalte, die für die starke biologische Aktivität verantwortlich waren. Wegen dieser uterotonischen Wirkung sind die Cyclotide interessant für die Forscher geworden. Weitere Untersuchungen haben viele andere biologische Aktivitäten wie antimikrobille, insektizide, antikrebs, anti-HIV und immunosuppressive Wirkung festgestellt. Um alle diese Effekte auszuüben, soll das Cyclotid zuerst mit den zellulären Membranen der lebenden Organismen interagieren. Dafür existiert eine elektrostatische Interaktion zwischen die Peptide und die zelluläre Membran, die durch die Wechselwirkung zwischen die positiv geladenen Reste der Cyclotide und die negativ geladenen Membrankopfgruppen entstanden ist. Die kalata B1 Mutante [T20K] kalata B1, wo das Threonin an der Position zwanzig mit einem Lysin ausgetauscht worden ist, zeigte in vorangegangenen Studien einen antiproliferativen Effekt auf Lymphozyten. Obwohl der genaue Mechanismus, der dieser Wirkung zu Grunde liegt, bis heute unbekannt ist (Gründemann et al., 2013), unterdrückt das Cyclotid [T20K] kalata B1 die Proliferation von den T-Zellen. Ziel dieser Arbeit war zu bestätigen, dass das Fluoreszein-getaggte Peptid T20K (T20K-CF) durch die Zellmembrane von anti-CD3 isolierten primären T-Zellen und Jurkat Zellen penetrieren kann. Die Interaktion zwischen das Peptid und die Lipiddoppelschicht wurde in einem dosis-, zeit- und temperaturabhängigen Studium untersucht. Es wurde festgestellt, dass mit Verlängerung der Inkubationszeit und Erhöhung der Konzentration größere Mengen an Peptid in die Zelle aufgenommen wurden. Zusätzlich durch mikroskopische Beobachtung wurde festgestellt, dass dadurch auch die Zytotoxizität erhöht wurde. Die Ursache für die Schädigung der Zellmembran könnte mit der Fähigkeit der Cyclotiden Poren an Lipiddoppelschichten zu bilden erklärt werden. Zusätzlich dieser Prozess könnte eine Methode sein, um Peptide direkt und energiefrei aufzunehmen. Jedoch, bei niedriger Temperatur wurde die Peptidaufnahme reduziert was ein Beweis dafür ist, dass die energieabhängige Endocytose auch beteiligt ist. Das hat zu der Schlussfolgerung geführt, dass der Aufnahmemechanismus eine Mischung zwischen direkte Penetration und Endocytose ist.

Abstract

(Englisch)

Cyclotides have been isolated from plants of the families of Rubiaceae, Violaceae and Cucurbiceae and contain 28 to 37 amino acid residues which correspond to a mass range of 2500 – 4000 Da. They are circular proteins that are characterized by a head to tail cyclized backbone. At the molecular core of the peptides are three disulfide bonds which form a cyclic cystine knot. This structural motif is responsible for the stability and for the resistance of the cyclotides to thermal, chemical and enzymatic degradation. Moreover, these cyclic peptides are hydrophobic and this leads to a typical late elution from a RP–HPLC column. The history of cyclotides may be traced back at more than 50 years ago when Sandberg reported that African tribes have been using an extract from the plant Oldenlandia affinis to facilitate childbirth. Later the Norwegian doctor Lorents Gran made ethno botanical investigations and determined that it contained cyclic peptides which are responsible for the strong activity. Due to the previously investigated uterotonic activity, cyclotides got interested for scientists. Further research determined many other biological actions, including antimicrobial, insecticidal, anticancer, anti-HIV and immunosuppressive activity. To perform all these biological properties, the cyclotide interacts firstly with the cellular membrane of the living organisms. Moreover, the different subfamilies of cyclotides possess diverse mode of action. However, for all of them there is electrostatic interaction between the peptide and the cellular membrane due to the positively charged residues of the cyclotide and the negatively charged membrane head groups. Recent research reported that a mutant from the cyclotide kalata B1, where the threonine at position twenty is exchanged with a lysine, has an antiproliferative effect on lymphocytes. Although the main mechanism of action is still unclear, the cyclotide [T20K] kalata B1 suppresses the proliferation of T-cells. Moreover, the aim of this study was to confirm, implementing anti-CD3 isolated primary T-cells and Jurkat cells as in-vitro model systems, if the fluorescently labeled [T20K] kalata B1 mutant (T20K-CF) can penetrate through the cellular membrane. The interaction has been investigated in a dose-, time- and temperature-dependent study. Moreover, with prolonging of the incubation time and increasing of the peptide concentration, higher amounts of peptide have been internalized into the cells. On the other hand, through microscopic observation it was examined that the cytotoxicity also increased. This may be due to the property of cyclotides to form pores in the cellular membrane which has been described in several papers. Furthermore, this property enables an energy-independent, direct transport through the cellular membrane. However, at low temperature the peptide penetration was reduced which is an evidence that endocytosis plays an important role for the mechanism of peptide uptake. These results strongly supported the involvement of both passive membrane passage and active cellular uptake by endocytosis of T20K-CF.

Autor*innen

Mina Krasimirova Vasileva

Haupttitel (Englisch)

Chemical derivatization and cellular imaging of immunosuppressive peptides

Paralleltitel (Deutsch)

Chemische Derivatisierung und zelluläre Darstellung von immunsuppressiven Peptiden

Paralleltitel (Englisch)

Chemical derivatization and cellular imaging of immunosuppressive peptides

Publikationsjahr

2014

Umfangsangabe

103 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Gernot Schabbauer

Klassifikationen

35 Chemie > 35.70 Biochemie: Allgemeines ,

42 Biologie > 42.12 Biophysik

AC Nummer

AC12083502

Utheses ID

30389

Studienkennzahl

UA | 066 | 834 | |

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Schlagwörter