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Structural and functional insights into the dynamic architecture of the budding yeast kinetochore
Francesca Malvezzi
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Stefan Westermann
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30461.58302.942463-6
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Eine der schwierigsten Aufgaben eukaryontischer Zellen ist die genaue Weitergabe der Erbinformation während der Zellteilung. Verschiedene Proteine sind an dieser Aufgabe beteiligt, darunter auch einer der grössten Proteinkomplexe der Zelle, das Kinetochor. Diese mehrere Millionen Dalton grosse Struktur verbindet die Schwesterchromatiden mit der Mitosespindel, und ihr Aufbau folgt einem konservierten Plan mit einem äusseren Teil, der an Mikrotubuli bindet, und einem inneren Teil, der die DNA des Zentromers erkennt und bindet. Ein Verständnis der Protein-Protein Interaktionen in der Verbindung zwischen äusserem und innerem Kinetochor ist notwendig, um die Funktionsweise des gesamten Komplexes zu verstehen. In dieser Arbeit habe ich mich auf Rekrutierungsmechanismen des mikrotubuli-bindenden Komplexes des Kinetochores, Ndc80 genannt, konzentriert. Ndc80 Rekrutierung erfolgt über zwei unterschiedliche Rezeptoren, das histon-ähnliche Protein Cnn1 und über den Mtw1 komplex. Mir ist es gelungen, die Verbindung zwischen Cnn1 und Ndc80 durch Röntgenkristallographie strukturell sichtbar zu machen. Dies hat gezeigt, dass Cnn1 eine N-terminale alpha-helix benutzt um an eine hydrophobe Vertiefung zwischen den globulären Spc24-25 Domänen des Ndc80 Komplexes zu binden. Basierend auf der Kristallstruktur konnte ich ein Cnn1-ähnliches Motiv in einer Untereinheit des Mtw1 komplexes identifizieren, das an die gleich hydrophobe Domäne des Ndc80 komplexes bindet und überlebenswichtig für die Hefe ist. Die Bindungspeptide sind funktionell austauschbar, was auf eine modulare Struktur der Interaktionsoberflächen innerhalb des Kinetochors schliessen lässt. Ausserdem schlage ich einen Mechanismus zur Phospho-regulierung der Interaktion durch die mitotische Kinase Mps1 vor, der die Interaktion zwischen Cnn1 und Ndc80 auf die Anaphase beschränkt. Die Modulation der Ndc80 Rekrutierung durch Cnn1 und den Mtw1 komplex zeigt an, dass das Kinetochor eine dynamische Einheit ist, die sich verschiedenen Aufgaben anpasst.
Während Cnn1 den Ndc80 komplex direkt mit der DNA verbindet, ist der Mtw1 komplex auf weitere Bindungspartner angewiesen, um das Zentromer zu erreichen. Gemeinsam mit meinen Kollegen konnte ich zeigen, dass dies durch kooperative Binding des Mtw1 komplexes durch zwei weitere essentielle Komponenten des inneren Kinetochors erfolgt: den Ame1CENP-U-Okp1CENP-Q Komplex und das Protein Mif2CENP-C. Ame1 und Okp1 bilden gemeinsam ein stabiles Heterodimer, das DNA in einer Art und Weise bindet, die mit gleichzeitiger Interaktion mit dem Mtw1 Komplex kompatibel ist.
Zusammengefasst lässt sich sagen, dass diese Arbeit eine Schlüsselverbindung innerhalb der Kinetochor Architektur strukturell beschreibt und kurze, peptid-artige Motive als Grundlage der Ndc80 Rekrutierung identifiziert. Ausserdem wird der Ame1-Okp1 Komplex als DNA-bindende Komponente beschrieben, was anzeigt das mehrere Untereinheiten des inneren Kinetochors an der Erkennung und Bindung des Zentromers beteiligt sind.
Abstract
(Englisch)
One of the most delicate tasks for all eukaryotic cells is to accurately distribute the genetic information during cell division. Several proteins are involved in this process including one of the largest machineries in the cell, the kinetochore. This mega-dalton sized structure physically links the sister chromatids to the mitotic spindle and displays a conserved building plan formed by an outer part, which connects to microtubules, and an inner part, which recognizes and binds the centromeric DNA. Understanding the protein-protein connectivity and the interactions at the inner-outer kinetochore interface is essential in order to ultimately uncover the kinetochore function.
In this work, I focused on recruitment mechanisms of the key microtubule-binding element of the kinetochore, the Ndc80 complex (Ndc80C), in Saccharomyces cerevisiae. Ndc80C recruitment takes place via two distinct receptors, the histone-like protein Cnn1CENP-T and the Mtw1 complex. I have succeeded in structurally visualizing the Cnn1-Ndc80 complex binding interface, revealing that Cnn1 employs an N-terminal alpha-helix for docking into a hydrophobic cleft formed at the interface of the Spc24-25 globular domains of the Ndc80 complex. Based on the crystal structure, I identified a Cnn1-related motif in one of the subunits the Mtw1 complex, necessary for targeting the same hydrophobic pocket of Ndc80C and essential for yeast viability. The two peptides are functionally interchangeable in vivo, revealing modular interaction principles in the kinetochore architecture. Additionally, I propose a mechanism of phospho-regulation of the Cnn1-Ndc80C interaction by the mitotic kinase Mps1 that serves to restrict this connection to anaphase. The modulation of the Ndc80 recruitment via Cnn1 and the Mtw1 complex suggests that the kinetochore is a dynamic entity that undergoes changes in structure in order to fulfill different tasks. While Cnn1 directly connects the Ndc80 complex to DNA, the Mtw1 complex has to establish additional interactions in order to reach the centromere. Together with my colleagues, I was able to show that this occurs through the cooperative binding of two essential inner kinetochore components, the Ame1CENP-U-Okp1CENP-Q complex and Mif2CENP-C. Ame1 and Okp1 form a stable heterodimer via their central coiled coil regions and are able to bind to DNA in vitro, in a manner that is compatible with simultaneous Mtw1 complex interaction.
Taken together, this work structurally describes a key connection within the architectural framework of the kinetochore and it reveals the presence of short, conserved motifs at the basis of the Ndc80C recruitment to the kinetochore. Moreover, it characterizes the Ame1-Okp1 complex as a DNA-binding component, suggesting the presence of multiple subunits of the inner kinetochore involved in centromere recognition.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
kinetochore Cnn1 Ndc80 centromere Ame1-Okp1
Schlagwörter
(Deutsch)
Kinetochor Cnn1 Ndc80 Zentromer Ame1-Okp1
Autor*innen
Francesca Malvezzi
Haupttitel (Englisch)
Structural and functional insights into the dynamic architecture of the budding yeast kinetochore
Paralleltitel (Deutsch)
Strukturelle und funktionelle Einblicke in die dynamische Kinetochor Architektur der Bäckerhefe
Publikationsjahr
2014
Umfangsangabe
138 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Kristina Djinovic ,
Andrea Musacchio
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC12090145
Utheses ID
30791
Studienkennzahl
UA | 094 | 490 | |