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Impact of vitrification on ovarian tissue and cells

Chrysanthi-Maria Kokotsaki

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Christian Schneeberger

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DOI

10.25365/thesis.34717

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29250.33996.903960-1

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Das Ovarian Tissue Banking (OTB) ist für Patientinnen mit dem Risiko eines frühzeitigen Verlustes der Eierstockfunktion eine Möglichkeit des Fertilitätserhalts. Diese seit ca. 15 Jahren angebotene Möglichkeit der Kryokonservierung von Ovargewebe betrifft vor allen Dingen jüngere Frauen mit onkologischen Erkrankungen, bei denen die notwendigen Therapien zu einer deutlichen Beeinträchtigung der Fertilität und der endokrinen Funktion führten. OTB kann durch zwei Verfahren erreicht werden: Langsames Einfrieren (Slow Freezing) und ultraschnelles Einfrieren (Vitrifikation). Heutzutage wird die Vitrifikation als Verfahren am häufigsten angewendet, da es vor allen Dingen mehr praktische Vorteile als das langsame Einfrieren bietet. Allerdings sind die bisherigen Daten zu diesen beiden Verfahren begrenzt und die Ergebnisse sind oft widersprüchlich und umstritten. In der vorliegenden Studie wurde anhand von Mausovarien (C57BL/6J Mäuse) und einer Granulosazelllinie (KGN) die Auswirkungen von zwei Vitrifikationlösungen und den dazugehörigen Protokollen auf die Vitalität und Proliferationsfähigkeit von Zellen und Ovarien untersucht, und die Genexpression ausgewählter Gene in der Granuloszelllinie analysiert. Die Vitalität und Proliferation der Zellen wurde mit Hilfe einer FACS Analyse bestimmt, für Mäuseovarien wurde zusätzlich die Progesteronproduktion mit Hilfe eines ELISA-Verfahren bestimmt. Es wurden folgende Gene mit Hilfe einer Real Time PCR analysiert: Fas, FasL, Bax, Bcl2, Bcl-xL, PLSCR4, TNF-a, HIF1A, LGALS, CIRBP1, RBM3, HSP47, HSPH1, HSP70, HSP27, FABP3, CRIPT. Die untersuchten Vitrifikationslösungen enthielten im ersten Fall Dimethylsulfoxid (DMSO) (Protokoll 1; P1) und im zweiten Fall Propandiol (PROH), Ethylenglykol (EG) und Saccharose als Gefrierschutzmittel (Protokoll 2; P2). Bei dieser Lösung handelte es sich um eine industriell hergestellte Lösung zur Vitrifikation von Oozyten im Rahmen einer in Vitro Fertilisations Behandlung. Die Experimente mit den Mäuseovarien ergaben, dass vitrifizierte Mäuseovarien deutlich weniger Progesteron produzieren als frische Ovarien, was als ein Hinweis auf mögliche Zellschädigungen des vitalen Gewebes durch den Einfrierprozess gewertet werden kann. Der Vergleich der Vitalität der KGN Zelllinie nach Behandlung mit den unterschiedlichen Vitrifikationslösungen ergab dass die Überlebensrate der Zelllen nach Behandlung mit P1, der DMSO-haltigen Lösung deutlich höher war als bei Behandlung mit P2. Beide Protokolle zeigten allerdings einen deutlichen Unterschied der Überlebensraten, gegenüber nicht behandelten Zellen auf, so dass auch hier ein negativer Effekt des Einfrierprozess als solcher angenommen werden muss. Ähnliches ergab auch eine Zellzyklusanalyse für vitrifizierte Zellen im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Hier zeigte sich eine geringere Anzahl von Zellen, in der G1 und G2 Phase, sowie eine Steigerung des Anteils von Zellen in der S-Phase in den vitrifizierten Proben. Auch der Vergleich der beiden Protokolle bezüglich der Expression der untersuchten Gene, zeigte, dass die Vitrifikation an sich im Vergleich zu nicht vitrifizierten Zellen, zu deutlichen Expressionsunterschieden führt. Auffallend ist jedoch, dass die Expression von TNF-alpha in beiden Protokollen gegenüber der Kontrolle deutlich gesteigert ist. Dies gilt insbesondere für das Protokoll 2, die industriell hergestellte Vitrifikationslösung. Da in den vorigen Experimenten gezeigt worden ist, dass die Vitalität der Zellen nach Behandlung mit P2 im Vergleich zu P1 deutlich vermindert ist, und eine hohe Expression von TNF-alpha in vielen Zellen Apoptose-induziert, lässt dies den Schluss zu, dass die Vitrifikation über einen TNF-alpha gesteuerten Mechanismus zu einer Abnahme der Zellvitalität führt. Da in den hier durchgeführten Experimenten dieser Prozess abhängig zu sein scheint, von dem jeweils benutzten Protokoll, kommt der Herstellung und Überprüfung kommerzieller Vitrifikationslösungen, die im klinischen Bereich angewandt werden, eine besondere Bedeutung zu.

Abstract

(Englisch)

Ovarian Tissue Banking (OTB) is an option of fertility preservation for patients at the risk of premature ovarian failure (POF). This type of ovarian tissue cryopreservation is offered since 15 years, and concerns especially young women suffering from cancer and due to the necessary treatments a significant fertility and endocrine function impairment can occur. OTB can be accomplished by two methods: slow freezing and vitrification. Nowadays, the vitrification method is applied most often, as it seems to provide more benefits than slow freezing. However, data on both methods are still limited, and the results are often conflicting and controversial. The present study was based on mouse ovaries (from C57BL/6J mice) and on KGN cells, a human granulosa-like tumor cell line, to investigate two vitrification solutions and the related protocols on mouse ovaries viability, KGN viability and proliferation ability, and on KGN selected – gene expression analysis. The viability and proliferation of KGN cells was tested by FACs analysis. For the mouse ovaries was additionally measured the progesterone production by ELISA. Following genes were analyzed by Reak Time PCR: Fas, FasL, Bax, Bcl2, Bcl-xL, PLSCR4, TNF-a, HIF1A, LGALS, CIRBP1, RBM3, HSP47, HSPH1, HSP70, HSP27, FABP3, CRIPT. The two vitrification solutions tested, contained in the first case (Protocol 1; P1) dimethyl sulphoxide (DMSO), and in the second case (Protocol 2; P2) propanediol (PROH), ethylene glycol (EG), and Sucrose as cryoprotectants. The last solution is a commercial produced solution used for oocyte vitrification in in vitro fertilization treatment. Mouse ovaries experiments resulted that vitrified mouse ovaries produce less progesterone than fresh ovaries, which can be interpreted as an indication of possible cell damage of vital tissue by the freezing process. Comparing KGN cell line viability after treatment with the different vitrification solution showed that the survival rate after treatment with P1, the DMSO-containing solution, was much higher than the treatment with P2. However, both protocols showed a significant difference in survival rates, compared to untreated cells, leading to the adoption of the negative freezing process affect. Similar results were shown from cell cycle analysis, when vitrified cells were compared to untreated cells. A smaller number of cells were in G1 and G2 phase, as well an increase in the proportion of cells in S-phase was shown for the vitrified samples. In addition, the two protocols comparison regard to the selected-gene expression showed that vitrification, in contrast to the non-vitrified cells, changed the expression of the genes studied. Remarkable is the significant increase of TNF-alpha expression in both protocols, compared to the control, this occurs especially for P2, the industrially produced vitrification solution. As has been shown in previous experiments, cell viability is reduced after treatment with P2 compared to P1, and additionally TNF-alpha high expression can induce apoptosis in many cells, it can be concluded that through a TNF-alpha driven mechanism, vitrification process decreases cell viability. The experiments carried out in this study showed that vitrification process depends on the particular protocol used, therefore the preparation and verification of commercial vitrification solutions applied in the clinical field is particular important.

Autor*innen

Chrysanthi-Maria Kokotsaki

Haupttitel (Englisch)

Impact of vitrification on ovarian tissue and cells

Paralleltitel (Deutsch)

Der Einfluss der Vitrifikation auf Ovargewebe und Zellen

Paralleltitel (Englisch)

Impact of Vitrification on Ovarian Tissue and Cells

Publikationsjahr

2014

Umfangsangabe

117 S. : Ill., graf. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Christian Schneeberger

Klassifikation

42 Biologie > 42.20 Genetik

AC Nummer

AC12155559

Utheses ID

30799

Studienkennzahl

UA | 066 | 877 | |

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