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Comparison of two in vitro neural crest stem cell differentiation systems derived from human induced pluripotent stem cells under defined culture conditions
Song-Hi Kneutgen
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Ernst Müllner
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Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
DOI
10.25365/thesis.34881
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30269.98109.497762-6
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Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Die Neuralleiste ist ein charakteristisches Merkmal von Vertebraten und besteht aus einer transienten, multipotenten, embryonalen Zellpopulation. Um ihren Bestimmungsort zu erreichen legen diese, ausgehend von ihrem Ursprung, weite Strecken im Körper zurück. In Abhängigkeit von ihrem Bestimmungsort differenzieren die Nachkommen zu einer Vielzahl von unterschiedlichen Zelltypen. Deshalb können Störungen, die während der Entwicklung der Neuralleiste auftreten, zu schweren Geburtskrankheiten führen. Diese Krankheiten werden als „neurocristopathies” zusammengefasst. Aus diesem Grund, ist die Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) zu Neuralleistenzellen von großer Bedeutung, um die Entwicklung der Neuralleiste sowie die dazugehörigen Krankheitserscheinungen zu erforschen. Desweiteren erweckt diese Differenzierungsmethode großes Interesse in der Zelltherapie, in Hinblick auf patientenspezifische Krankheitsmodelle, sowohl auch als Modell einer unbegrenzten Quelle von Neuralleistenzellen. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei in vitro Zellkulturmodelle miteinander verglichen, um zu untersuchen, welche der beiden die effizienteste Methode darstellt um die größtmögliche Ausbeute von hiPSCs basierenden Neuralleistenzellen zu erreichen. Zu diesem Zweck wurden zwei bereits publizierte Methoden ausgewählt, welche die Differenzierung von hiPSCs zu Neuralleistenzellen induzieren. Dies erfolgte über Modifizierungen von intrazellulären Signalkaskaden unter feederzellfreien, definierten Zellkulturbedingungen. Unsere Ergebnisse bestätigen, dass die pharmakologische Inhibierung von TGF-β in Kombination mit einer Aktivierung von canonical WNT Signalweg eine höhere Ausbeute erzielt, als eine duale Blockade von SMAD Signalwegen. Die Charakterisierung dieser Zellen erfolgt über die Präsenz von zwei Oberflächenrezeptoren der Neuralleisten - HNK1+ und p75+. Die immunochemische Färbung (ICC) detektierte 68,22 % HNK1+p75+ Zellen, während via FACS Analyse 35,2 % HNK1+p75+ Zellen ermittelt wurden. Dem gegenübergestellt ergaben die ICC Auswertungen mittels dual SMAD Inhibierung nur 13,68 % HNK1+p75+ Zellen. Die FACS Untersuchung zeigte 7,4 % HNK1+p75+ Zellen. Jedoch benötigten beide Methoden im Anschluss einen Zellsortierungsschritt um eine pure Zellpopulation zu erhalten. Um die Multipotenz der Zellen der Neuralleiste zu demonstrieren wurde eine osteogene Differenzierung ausgehend von unsortierten HNK1+p75+ Zellen, FACS sortierten HNK1+p75+ Zellen, mesenchymale Stammzellen (MSCs) und epidermale Zellen der Neuralleiste (hEpi-NCSCs) initiiert. Der biochemische Nachweis des Enzyms Alkalische Phosphatase sowohl auch die Alizarin Red Färbung haben deutlich gezeigt, dass die höchste Mineralisierung in unsortierten HNK1+p75+ Zellen stattgefunden hat.
Abstract
(Englisch)
The neural crest (NC) is a characteristic feature of vertebrates consisting of a transient multipotent embryonic cell population. In early development, NC stem cells (NCSCs) migrate through the body and contribute to various organ systems. Abnormal development of NCSCs can lead to several severe birth defects summarized as neurocristopathies. Generation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)-derived NCSCs represents a valuable tool for studying the biology of NC development and diseases. Moreover, hiPSCs-derived NCSCs have become a promising technology as patient-specific disease model and availability of unlimited numbers of NCSCs might serve as cell source for cell therapy and tissue engineering. In this work, we performed in vitro NC differentiation systems to investigate the most effective method for producing high amounts of hiPSCs-derived NC-like cells. To this end, two methods that induce NC differentiation through modified signaling pathways under defined culture conditions were tested. Our outcomes revealed that pharmacological inhibition of transforming growth factor-β (TGF-β) combined with activated WNT signaling yields more hiPSCs derived NC-like cells compared to pharmacological inhibition of bone morphogenic protein (BMP) and TGF-β. Activated WNT signaling combined with TGF-β inhibition yielded 68.22 % HNK1+p75+ cells detected by immunocytochemistry (ICC) staining while fluorescent activated cell sorting (FACS) analyzed 35.2 % HNK1+p75+ cells. In contrast, dual SMAD blockade produced only 13.68 % HNK1+p75+ cells monitored by ICC evaluation and 7.4 % HNK1+p75+ cells determined by FACS analysis. However, both methods required cell-sorting for HNK1 and p75 surface receptors to obtain highly purified NC-like cells. To proof NC multipotency, osteogenic differentiation was induced with unsorted NC cells obtained by activated canonical WNT signaling and TGF-β suppression, FACSorted hiPSCs-derived NC-like cells, human mesenchymal stem cells (hMSCs), and human epidermal neural crest stem cells. Alkaline phosphatase (ALP) assay and Alizarin red staining verified that unsorted hiPSCs derived NC-like cells possessed highest potential to differentiate towards osteogenic lineage compared to FACSorted hiPSCs derived NC-like cell population, hMSCs and hEpi-NCSCs.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
cell differentiation system human induced pluripotent stem cells neural crest stem cells
Schlagwörter
(Deutsch)
2D-Differenzierungsmodelle humane induzierte pluripotente Stammzellen Neuralleistenzellen
Autor*innen
Song-Hi Kneutgen
Haupttitel (Englisch)
Comparison of two in vitro neural crest stem cell differentiation systems derived from human induced pluripotent stem cells under defined culture conditions
Paralleltitel (Deutsch)
Vergleich von zwei in vitro Zellkulturmodellen zur Herstellung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen basierenden Neuralleistenzellen unter definierten Zellkulturbedingungen
Publikationsjahr
2014
Umfangsangabe
XX, 101 S. : Ill., graf. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Ernst Müllner
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC12155495
Utheses ID
30937
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |
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