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Characterization of unknown mutations in the von Willebrand factor gene
Sarah Fink
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Biologie
Betreuer*in
Raute Sunder-Plaßmann
DOI
10.25365/thesis.35083
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29245.25355.384566-9
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Der von Willebrand Faktor (vWF) ist ein großes Glykoprotein, welches eine ent-scheidende Rolle in der primären Hämostase spielt. Defekte in diesem Protein führen zum von Willebrand Syndrom (vWS), der häufigsten angeborenen Blut-gerinnungsstörung. vWS wird durch ein quantitativ oder qualitativ defektes vWF Protein verursacht und unterteilt sich in drei Typen. Bei Typ 1 vWS liegt ein quantitativer Defekt des Proteins vor, während Typ 2 vWS, das in vier Sub-typen unterteilt wird, durch qualitative Defekte von vWF charakterisiert wird. Typ 3 vWS ist die klinisch am stärksten ausgeprägte Form des vWS, da das Protein komplett fehlt.
In dieser Masterarbeit wurden 39 Patienten mit reduziertem vWF:Ag und/oder vWF:RCo Aktivität, bei welchen ein Verdacht auf vWS vorliegt, durch die Se-quenzierung des kompletten VWF Gens auf Mutationen im VWF Gen unter-sucht. In 19 Individuen wurden vWS assoziierte Mutationen gefunden: acht neue Mutationen und neun Mutationen, welche bereits in der Literatur be-schrieben sind. Zwei dieser bereits bekannten Mutationen wurden in je zwei verschiedenen Individuen detektiert.
Bei drei der acht neuen Mutationen handelt es sind um heterozygote Spleiß-stellen an den Positionen c.3379+2T>C, c.3538+2T>C und c.5312-2A>G. Durch mRNA Analyse wurde festgestellt, dass die Mutation c.3538+2T>C im Intron 26 zum Überspringen von Exon 26 führt. Diese Region des vWF Proteins ist für die Bindung von vWF an die beschädigte Matrix des Subendothels verantwortlich.
Die anderen fünf neu identifizierten heterozygoten Mutationen befinden sich in exonischen Regionen des Gens. Deren Auswirkung auf die Funktion des vWF Proteins wurde durch in silico Methoden vorhergesagt. Verwendet wurden die Programme PolyPhen-2, Project HOPE und Align GVGD.
Der Aminosäureaustausch p.Asn1231Ser befindet sich in der D3 Domäne des vWF Proteins und führt vermutlich zu einer fehlerhaften Faltung des Proteins. Dadurch kann der vWF nicht aus der Zelle exportiert werden.
Die drei exonischen Mutationen p.Arg1274Trp, p.Glu1305Asp und p.His1419Pro befinden sich in der A1 Domäne des vWF und führen vermutlich zu einer veränderten Bindung an GpIb.
Die Mutation p.Arg1830Ser wurde in der A3 Domäne des vWF gefunden. Diese Mutation führt vermutlich – durch eine möglicherweise verminderte vWF-Kollagen Bindung – zu moderaten bis schwerwiegenden Blutgerinnungsstö-rungen.
Um die funktionellen Auswirkungen der gefundenen neuen Mutationen festzu-stellen, ist es notwendig, VWF Konstrukte, die die Mutationen enthalten, herzustellen und in Säugerzellen zu transfizieren. Mit Hilfe funktioneller vWF Tests können unterschiedliche Eigenschaften der produzierten mutierten vWF Proteine dann im Vergleich zum vWF eines gesunden Individuums in vitro unter-sucht werden.
In dieser Studie wurden in 19 von 39 Individuen Mutationen im VWF Gen ge-funden. Acht dieser Mutationen sind nicht in der Literatur beschrieben und in silico Methoden sagen eine Auswirkung auf die Struktur des vWF Proteins voraus.
Abstract
(Englisch)
The von Willebrand factor (vWF) is a large glycoprotein, which plays an important role in primary hemostasis. Defects in this protein lead to von Willebrand disease (VWD), the most common inherited bleeding disorder. It is caused by quantitative or qualitative defects of vWF and is classified in three subtypes. Type 1 VWD is characterized by a partial quantitative deficiency of vWF, type 2 VWD is subdivided in four subtypes and characterized by qualitative defects of vWF and type 3 VWD is the most severe form of VWD characterized by a complete absence of vWF.
In this master thesis 39 patients with reduced vWF:Ag and/or reduced vWF:RCo activity suspected to suffer from VWD were analyzed for mutations in the VWF gene. The mutations were detected by sequencing of the complete VWF gene.
In 19 individuals VWD causing mutations were identified: eight novel variants, and nine variations that are already described in the literature. Two of the al-ready described mutation were detected twice.
Three out of the eight novel variants are putative splice site mutations. Two of them are located at the donor site of an intron (c.3379+2 T>C; c.3538+2 T>C) and one is located at the acceptor site of an intron (c.5312-2A>G). All three mutations were detected heterozygously. c.3538+2T>C in intron 26 leads to exon 26 skipping as detected by mRNA analysis. This region of the vWF protein is essential for the binding of vWF to damaged subendothelial matrix.
The other five identified novel mutations are located in exonic regions and oc-curred heterozygously. The putative impact of them on the function of vWF was predicted by in silico assessments such as PolyPhen-2, Project Hope and Align GVGD. All of them potentially leading to a qualitative defect of vWF and are associated with type 2 VWD.
Amino acid substitution p.Asn1231Ser is located in the D3 domain of vWF and is suspected to cause defective folding of the protein. As a consequence, vWF cannot be exported out of the cell.
The three exonic variations p.Arg1274Trp, p.Glu1305Asp and p.His1419Pro are located in the A1 domain of vWF and are potentially associated with an altered GpIb binding ability of vWF.
In the A3 domain of vWF variation p.Arg1830Ser was identified. This mutations is suspected to be associated with moderate to severe bleeding symptoms be-cause of decreased vWF-collagen binding.
For final characterization of this novel exonic mutations VWF constructs have to be transfected into a mammalian host cell line to express recombinant vWF proteins. By comparing the function of vWF proteins derived from the VWF se-quence of a healthy individual with those obtained by additionally introducing single
potentially causal mutations for VWD by site directed mutagenesis, the conse-quences of these novel mutations can be assessed in vitro.
In this study, in 19 out of 39 individuals mutations in the VWF gene were identified. Eight of those mutations are not described in the literature but are predicted by in silico assessments to cause VWD.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
VWD VWF VWF gene VWF protein VWD types VWD characterization
Schlagwörter
(Deutsch)
VWF VWS VWS Typen VWS Charakterisierung
Autor*innen
Sarah Fink
Haupttitel (Englisch)
Characterization of unknown mutations in the von Willebrand factor gene
Paralleltitel (Deutsch)
Charakterisierung unbekannter Mutationen im von Willebrand Faktor Gen
Publikationsjahr
2014
Umfangsangabe
IV, 91 S. : graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Raute Sunder-Plaßmann
Klassifikationen
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines ,
44 Medizin > 44.48 Medizinische Genetik
AC Nummer
AC12223189
Utheses ID
31106
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |