Detailansicht
The role of melatonin in blood pressure modulation
characterization of specificity of anti-melatonin receptor 1 (MT 1) antibodies
Andreas Maier
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Diplomstudium Pharmazie
Betreuer*in
Walter Jäger
DOI
10.25365/thesis.35175
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29701.08538.832265-7
Link zu u:search
(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Einleitung: Melatonin ist ein körpereigenes Hormon, das in der Zirbeldrüse gebildet und ins
Blut abgegeben wird. Die Produktion wird durch einen inneren Taktgeber, den
Suprachiasmatischen Kern, gesteuert und findet nur bei Abwesenheit von Licht statt. Daher
ist die Konzentration von Melatonin im Blut in der Nacht am höchsten. Neben seiner
Hauptaufgabe, der Kontrolle von zirkadianen Rhythmen, besonders des Schlaf-Wach-
Rhythmus, beeinflusst das Hormon viele andere Körperfunktionen, wie etwa den Blutdruck.
Studien haben eine blutdrucksenkende Wirksamkeit sowohl bei Tieren als auch beim
Menschen gezeigt. Eine rezente Meta-Analyse bestätigte, dass Präparate mit kontrollierter
Freisetzung den systolischen und diastolischen Blutdruck signifikant und im klinisch
relevanten Bereich senken können. Melatonin wird daher als potentielles
blutdrucksenkendes Mittel angesehen, wobei die zugrunde liegenden Mechanismen nicht gut
verstanden sind. Als eine Möglichkeit der Blutdruckregulation wird eine direkte Wirkung von
Melatonin auf den Gefäßwiderstand über die spezifischen G-Protein-gekoppelte Melatonin-
Rezeptoren, MT 1 und/oder MT 2 genannt. Beide Rezeptoren wurden in verschiedenen
Rattengefäßen (Aorta, Rattenschwanz und Hirnarterien) nachgewiesen, allerdings nur auf
mRNA Ebene in totalen Gewebslysaten. Die Verteilung und zellspezifische Funktionen von
MT 1 bzw. MT 2 Proteinen in strukturellen Schichten der Gefäßwand, d.h. Endothelzellen,
glatten Muskelzellen oder Zellen innerhalb der Tunica adventitia oder dem perivaskulären
Fettgewebe (PVAT) müssen noch umfassend untersucht werden, um den Zusammenhang
zwischen Melatonin und dessen blutdrucksenkender Wirkung zu verstehen. Unveröffentlichte
Daten unserer Arbeitsgruppe zeigten MT 1 mRNA Expression in mesenterischen
Rattenarterien (MA) und deren umgebenden PVAT. Publizierte Studien anderer Gruppen
deuten darauf hin, dass die antikontraktilen Funktionen von MA assoziiertem PVAT durch
noch unbekannte Mechanismen von Melatonin beeinflusst werden. Proteinexpression und
Lokalisation von MT 1 in MA und dessen PVAT sind zurzeit unbekannt. Der Mangel an
Informationen über die Melatonin Rezeptor Proteinexpression und -lokalisation im
Rattengewebe beruht größtenteils auf der mangelhaften Charakterisierung kommerzieller
MT 1 und MT 2 Antikörper. In diesem Kontext ist Western Blotting nicht nur die wichtigste
Technik um Proteinexpression im Gewebe nachzuweisen, sondern auch unverzichtbar um
die Spezifität eines Antikörpers zu untersuchen.
Ziele: Diese Diplomarbeit hatte zwei Hauptziele. Erstes Ziel war die Untersuchung der
Spezifität von drei kommerziell erworbenen anti-Ratten MT 1 Antikörpern der Firmen, Biorbyt,
Santa Cruz Biotechnology und Alomone Labs, mittels Western Blotting. Zweites Ziel war der
Nachweis von MT 1 Proteinexpression in mesenterischen Rattenarterien (MA) und
perivaskulären Fett (PVAT) mit dem spezifischsten der drei getesteten Antikörper.
Methoden: Die Spezifität der Antikörper und die Proteinexpression wurde mit Western
Blotting Technik analysiert. Die verwendeten Gewebe stammten von Wistar Ratten. Aus
Auge, Hirn und Kleinhirn (Positivkontrollen), Blutplasma (Negativkontrolle), sowie
mesenterische Arterie (MA) und umgebendes perivaskuläres Fett (PVAT) wurden entweder
mit T-PER Puffer totale Proteinlysate, oder mit Mem-PER Membranproteinlysate hergestellt.
Diese wurden mit SDS-PAGE aufgetrennt, auf PVDF-Membranen geplottet und über
indirekten Nachweis mit HRP-konjugierten sekundären Antikörpern und Chemilumineszenz
Substraten entwickelt.
Resultate: Die drei getesteten Antikörper zeigten signifikante Unterschiede in ihrer
Spezifität. Der anti-MT 1 Antikörper der Firma Alomone Labs reagierte mit Proteinen im
erwarteten Molekulargewichtsbereich von MT 1 (40-60 kDa) in allen Positivkontrollen. Diese
Signale waren spezifisch, da in Gegenwart des entsprechenden kompetitierenden Peptides,
welches zur Herstellung des Antikörpers verwendet worden war, keine Signale mehr
detektiert wurden. Außerdem zeigte dieser Antikörper weder eine Reaktion mit Albumin noch
mit IgG. Beides sind Hauptproteine des Blutplasmas, ihre Gegenwart wurde aber auch in
vielen Geweben nachgewiesen. Der Antikörper der Firma Biorbyt reagierte zwar mit
Proteinen im Molekulargewichtsbereich von MT 1 , zeigte aber auch eine signifikante
Kreuzreaktion mit Albumin. Der letzte getestete Antikörper, von der Firma Santa Cruz, zeigte
überwiegend Kreuzreaktionen mit Albumin, die Unspezifität des Antikörpers wurde in
Experimenten mit kompetitierenden Peptid bestätigt. Eine Proteinexpression von MT 1 in MA
und MA-PVAT konnte mit dem Antikörper von Alomone Labs eindeutig nachgewiesen
werden. Die Resultate dieser Diplomarbeit ermöglichten in weiterer Folge die Lokalisation
von MT 1 in Ratten MA und PVAT unter Verwendung des spezifischen Antikörpers von
Alomone Labs. Dabei wurde MT 1 in Muskelzellen von MA und in den Adipozyten von MA-
PVAT lokalisiert. Die Resultate wurden als Abstract und Poster am 5. Retreat des Zentrums
für Pathophysiologie, Infektiologie und Immunologie im September 2014 präsentiert.
Zusammenfassung und Ausblick: Zwei von drei untersuchten kommerziellen Antikörpern
gegen Ratten MT 1 zeigten signifikante Kreuzreaktionen mit Albumin. Kreuzreaktionen von
Antikörpern mit irrelevanten Proteinen wie Albumin sind auch in der Literatur beschrieben
und die Resultate dieser Arbeit unterstreichen die Wichtigkeit, Antikörper auf ihre Spezifität
zu testen bevor Studien zur Expression und Lokalisation der Proteine durchgeführt werden.
Der erfolgte Nachweis von MT 1 in MA und MA-PVAT in dieser Diplomarbeit war die
Voraussetzung für zukünftige funktionelle Studien in isolierten Zellen der relevanten
Gewebsabschnitte. Diese sollen zu einem besseren Verständnis der Interaktion von
Melatonin mit MT 1 und den nachfolgenden zellulären Mechanismen führen, die auf die
Blutdruckregulation einwirken.
Abstract
(Englisch)
Background: The hormone melatonin is secreted by the mammalian pineal gland in the
absence of light during the night. A major function of pineal-derived melatonin is the control
of circadian and seasonal rhythmicities via the biological master clock, the suprachiasmatic
nucleus. In addition, melatonin influences various body functions such the cardiovascular
system. Studies in animals and humans indicate that melatonin impacts on blood pressure. A
recent meta-analysis concluded that controlled-release melatonin significantly lowers systolic
and diastolic blood pressure by a magnitude that is considered to be clinically relevant.
Melatonin is therefore regarded as a putative antihypertensive agent. One of the
mechanisms discussed for the anti-hypertensive effects of melatonin is a direct impact on the
resistance of peripheral vessels via specific G protein-coupled melatonin receptors, MT 1
and/or MT 2. MT 1 and/or MT 2 expression was demonstrated in several rat vessels such as
aorta, cerebral and caudal arteries, but mainly at mRNA level in total vessel tissue.
Distribution and cell-type specific function of MT 1 and/or MT 2 protein in the diverse structural
layers of the vessel walls, i.e. endothelial cells, smooth muscle cells or cells within tunica
adventitia and perivascular fat tissue (PVAT) remain to be explored comprehensively to
understand the relation between melatonin and peripheral blood pressure control. Our
unpublished data have shown MT 1 mRNA expression in mesenteric arteries (MA) and their
associated PVAT, which participate in blood pressure regulation and published studies
suggested that melatonin influences the anti-contractile function of MA-associated PVAT via
yet unknown mechanisms. MT 1 protein expression and localization in MA and PVAT,
however, are currently unknown. The lack of information concerning melatonin receptor
protein expression and localization is related to the fact that the available anti-MT 1 and MT 2
antibodies, especially those for rodents, are not well characterized. In this context, western
blotting is not only the most important technique to evaluate protein expression in tissues but
is also indispensable to show the specificity of antibodies.
Aim: This diploma thesis had two major aims. First, to determine specificity and cross-
reactivity of three commercial anti-rat MT 1 antibodies obtained from the companies Biorbyt,
Santa Cruz Biotechnology and Alomone Labs by western blotting. Second, applying the most
specific antibody identified, confirm translation of MT 1 protein in MA and MA-associated
PVAT.
Methods: Specificity of antibodies and protein expression was analysed by western blotting.
Various tissues were derived from Wistar rats. Eye, brain and cerebellum (positive controls),
blood plasma (negative control), as well as MA and MA-PVAT protein lysates were prepared
either with T-PER buffer for total, or with Mem-PER for membrane protein fractions. Proteins
were separated by 12 % SDS-PAGE, blotted on PVDF membranes and processed with an
indirect detection protocol, using secondary HRP-conjugated antibodies, and
chemiluminescence detection.
Results: The three tested antibodies exhibited significant differences in their specificity. Anti-
rat MT 1 from company Alomone Labs reacted with proteins in the expected molecular weight
range of MT 1 (40-60 kDa) in all positive control tissues. Specificity of binding was assessed
with a blocking peptide, which completely abolished the binding of the antibody. Cross-
reaction of antibodies with albumin is an often observed and published phenomenon. The
Alomone Labs antibody did neither cross-react with albumin nor IgG, two major serum
proteins, which were detected in most tissue lysates. The antibody from Biorbyt reacted with
proteins of molecular weight corresponding to MT 1 , but additionally exhibited significant
cross-reaction with albumin. The antibody from Santa Cruz reacted predominantly with
albumin, and binding could not be reduced with the corresponding blocking peptide. Using
the anti-rat MT 1 antibody from Alomone Labs, expression of MT 1 protein in MA and MA-
PVAT was subsequently demonstrated by western blotting in total protein as well as
membrane protein lysates, confirming translation of MT 1 mRNA in these tissues. The results
of this thesis enabled subsequent investigation of localization of MT 1 in rat MA and MA-PVAT
using the Alomone Labs antibody. MT 1 protein expression was shown in muscle cells of MA
and in adipocytes of PVAT. Data demonstrating MT 1 mRNA and protein expression as well
as localization in rat MA and surrounding PVAT were presented as an abstract and poster at
the 5th retreat of the Center for Pathophysiology, Infectiology and Immunology in September
2014.
Summary and Outlook: Two out of three investigated antibodies exhibited significant cross
reactivity with albumin. Cross-reactions with irrelevant proteins such as albumin have been
described in literature and the results of this thesis underline the importance of antibody
specificity testing prior to protein expression and localization studies. Presence of MT 1 protein
in MA and MA-PVAT opens the way for future functional studies in in vitro systems that need
to explore in more detail the interaction of melatonin with MT 1 and the subsequent cellular
events that influence blood pressure.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
melatonin receptor 1 antibody specificity western blot mesenteric artery perivascular adipose tissue
Schlagwörter
(Deutsch)
Melatonin Rezeptor 1 Antikörper Spezifität Western Blot mesenterische Arterie perivaskuläres Fettgewebe
Autor*innen
Andreas Maier
Haupttitel (Englisch)
The role of melatonin in blood pressure modulation
Hauptuntertitel (Englisch)
characterization of specificity of anti-melatonin receptor 1 (MT 1) antibodies
Paralleltitel (Deutsch)
Untersuchungen zur Funktion von Melatonin in der Blutdruckregulation – Charakterisierung der Spezifität von anti-Melatonin Rezeptor 1 (MT1) Antikörpern
Paralleltitel (Englisch)
The role of melatonin in blood pressure modulation - Characterization of specificity of anti-melatonin receptor 1 (MT 1) antibodies
Publikationsjahr
2014
Umfangsangabe
81 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Walter Jäger
AC Nummer
AC12153686
Utheses ID
31185
Studienkennzahl
UA | 449 | | |