Detailansicht
Generation of avian sarcoma-leukosis viruses to achieve lymphatic-specific expression of a fluorescent marker in an ex-ovo CAM model
Kathrin Barbara Bracher
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Biologie
Betreuer*in
Peter Petzelbauer
DOI
10.25365/thesis.35399
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30161.06198.899664-8
Link zu u:search
(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Das Lymphsystem ist an einer Reihe von pathologischen Prozessen, wie zum Beispiel an der Tumorentstehung und an der Metastasierung, beteiligt. Das lymphatische System ist Teil des Blutkreislaufes und besteht aus Lymphgefäßen, die eine klare Flüssigkeit, genannt Lymphe (recyceltes Blutplasma), transportieren. Um die Studie der Metastasierung zu ermöglichen, wurde auf die Chorioallantoic Membran von Hühnerembryonen zurückgegriffen, die eine große Membranfläche von frei zugänglichen Lymph- und Blutgefäßen besitzt, welche eine in-vivo Manipulation und die Abbildung von Gefäßen ohne invasive Eingriffe ermöglichen. Um die Lymphgefäße im Modelorganismus darstellen zu können wurde eine replikationskompetentes aviäres Leukosevirus mit einem splice acceptor (RCASBP) und das selbe Virus ohne einen splice acceptor (RCANBP) generiert. Den größten Vorteil bildet die Replikationskompetenz, die es dem Virus erlaubt, sich horizontal in Nachbarzellen sowie auch vertikal in Tochterzellen zu vermehren. Durch diese Eigenschaft wird die generalisierte Infektion und Transgenität innerhalb einer Generation ermöglicht.
Das Hauptziel dieser Diplomarbeit war es, einen Vektor zu konstruieren, der ausschließlich in Lymphgefäßen exprimiert wird. Als idealer Marker bietet sich Prox1 an, welcher in Blutgefäßen außer in den Jugulargefäßen nicht exprimiert wird und in den meisten Spezies hoch konserviert ist. Das Prox1 Bindungsmotiv wurde sechsmal hintereinander geschalten, gefolgt von verschiedenen Promoter Elementen und dem eGFP Gen, welches als fluoreszierendes Markerprotein fungiert. In diesem Fall wurden Promotorelemente vom Zytomegalievirus und der Thymidinkinase verwendet, um eine spezifische Expression von eGFP in Lymphangioblasten zu erzielen. Das Projekt umfasste methodisch die Konstruktion von spezifischen Plasmiden unter Verwendung eines Subcloning Vektors, die Infektion von Hühnerfibroblastenzellen die Viruspartikel produzieren und die Konzentration von Viren mittels Ultrazentrifugation. Das Viruskonzentrat wurde dann in die Keimscheiben der Hühnerembryonen injiziert und anschließend wurden die Embryonen vom achten bis zum vierzehnten Tag auf eine spezifische eGFP Expression hin untersucht.
Zusammengefasst war der minimal CMV Promoter ausreichend um eine starke Marker Genexpression in Hühner DF-1 Zellen auszulösen, genauso wie in Hühnerembryonen und deren CAM, während der minimal Thymidinkinase Promoter zu einer merklich geringeren eGFP Expression in den DF-1 Zellen und im Embryo führte. Des Weiteren wurde bemerkt, dass Viren mit dem Fragment, welches inline mit den viralen Genen eingebracht wurde, eine stärkere Expression von eGFP zeigte, als Viren, die das Fragment inverse integriert hatten, sowohl in vitro (DF-1 Zellen) als auch in vivo (Hühnerembryo und CAM). Allerdings war es nicht möglich eine spezifische Expression von eGFP in lymphendothelalen Zellen mit einem unserer verschiedenen Vektorkonstrukte zu erzielen.
Abstract
(Englisch)
The lymphatic vasculature is involved in a number of pathological conditions such as neoplasm and metastasis. It is part of the circulatory system and built up from lymph vessels that carry a clear fluid called lymph, which is recycled blood plasma. To enable a study of metastasis, the chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos, which constitutes a large membrane area nerved with blood and freely accessible lymphatic vessels, is used to allow in-vivo manipulation and imaging of the vessels without invasive interventions. To visualize the lymph vessels in the model organism a strategy involving a replication-competent avian sarcoma-leukosis virus with a splice acceptor, Bryan RSV Polymerase (RCASBP) and the same virus without the splice side (RCANBP) were used. The virus is able to spread horizontally to neighbouring cells after infection, as well as vertically to daughter cells, thus allowing ubiquitous infection and transgenesis of embryos in a single generation.
The main objective of this research was to construct a virus, which drives gene-expression exclusively in lymphatic cells. An appropriate marker for lymph vessels is Prox1, which is not expressed in in blood vessels except of the jugular vessel and strong conserved in most species. To achieve lymphatic specificity the binding motif of Prox1 was used six times consecutively, followed by different promoter elements and the eGFP gene, which served as fluorescent marker. As such promoter elements, CMV and thymidine kinase (TK) promoters were utilized to drive specific expression of eGFP in lymph endothelial cells. Methodically the project involved the construction of a specific plasmid using a subcloning vector, infection of chicken fibroblast cells to produce virus particles and concentration of the virus via ultracentrifugation. The concentrated virus was then injected into the germ discs of the chicken embryos. Following the embryos were screened from day eight to fourteen for lymph specific eGFP expression.
To conclude, the minimal CMV promoter is sufficient to strongly drive gene expression in chicken DF-1 cells, as well as ubiquitously in the chicken embryo and CAM, while using the minimal TK promoter led to markedly lower eGFP expression in DF-1 cells and embryo. Further, it was noticed that viruses with the fragment of the subcloning vector inserted inline with the viral genes showed a stronger expression of eGFP then the virus with the fragment integrated inversely in vitro (DF-1 cells) and in vivo (chicken embryos and CAM). However, it was not possible to achieve specific expression of eGFP in lymph endothelial cells, with any of the different vector constructs.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Chicken embryo RCANBP RCASBP Lymph vessels eGFP
Schlagwörter
(Deutsch)
Hühnermbryo RCANBP RCASBP Lymphgefäße eGFFP
Autor*innen
Kathrin Barbara Bracher
Haupttitel (Englisch)
Generation of avian sarcoma-leukosis viruses to achieve lymphatic-specific expression of a fluorescent marker in an ex-ovo CAM model
Paralleltitel (Deutsch)
Herstellung eines aviären Leukosevirus um eine lymphspezifische Expression eines floureszenten Markers in einem ex-ovo CAM Model zu erzielen
Publikationsjahr
2014
Umfangsangabe
72 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Peter Petzelbauer
Klassifikationen
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.03 Methoden und Techniken in den Naturwissenschaften ,
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.99 Naturwissenschaften allgemein: Sonstiges
AC Nummer
AC12191440
Utheses ID
31370
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |