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Computationally assisted mining and processing of proteomics data of Medicago truncatula under drought stress

David Benjamin Lyon

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Doctor of Philosophy-Doktoratsstudium NAWI Bereich Lebenswissenschaften (Dissertationsgebiet: Biologie)

Betreuer*in

Stefanie Wienkoop

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URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29598.76832.158366-3

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Molekulare Systembiologie zielt darauf ab, unter Verwendung von „omics“ Technologien so viele biochemische Substanzen wie möglich zu detektieren. Ein spezifischer Teil dieser Forschung konzentriert sich auf die Verwendung von Massenspektrometrie zur Detektion von Analyten in Pflanzen, wie z.B. Primär- und Sekundärmetabolite, Peptide und Proteine. Spezialisierte Massenspektrometer (Tripel Quadrupol oder Lineare Ionen Falle/Orbitrap) werden in Abhängigkeit der zu untersuchenden Analyten und unter Berücksichtigung des Forschungsvorhabens verwendet. Instrumentelle Methoden zur Datenaufnahme müssen mit dem Gerät abgestimmt werden. Da die erzeugten Daten, abhängig von der Methode zur Datenaufnahme, sehr groß und komplex sein können, werden darauf angepasste computergestützte Methoden benötigt. Es wurde eine nichtgerichtete LC/MS-Methode zur Detektion von pflanzlichen Sekundärmetaboliten aus Rohextrakten von Arabidopsis thaliana entwickelt. Um biochemische Stoffwechselwege zu vernetzen, wurden Metabolit-Daten aus dem primären und sekundären Stoffwechsel integriert. LC/MS-Datenaufnahme, Datenextraktion und Datenanalyse sind Gegenstand der Diskussion dieser Arbeit. Der Mass-Western, eine massenspektrometriebasierte Methode zur Absolutquantifizierung von ausgewählten Proteinen, wird unter Berücksichtigung der Wahl der zu verwendenden Instrumente beschrieben. Diese Methode wurde mit dem Konzept von kreuzweise zusammenhängenden Standardpeptiden zur exakten stöchiometrischen Quantifizierung von Proteinkomplexen erweitert und angepasst. Medicago truncatula, ein sequenzierter Modellorganismus von Leguminosen, besitzt die Fähigkeit mit stickstofffixierenden Bakterien Zucker gegen Ammonium auszutauschen. Dieser Prozess wird als symbiotische Stickstofffixierung (SSF) bezeichnet. Da Leguminosen zu den für Menschen wichtigsten Pflanzenfamilien zählen, ist SSF ein global wichtiger und wesentlicher Prozess für nachhaltige landwirtschaftliche Systeme. SSF reagiert empfindlich auf Umweltstress, insbesondere auf Trockenheit, da diese 161 SSF hemmt und folglich Ernteerträge reduziert. Die Reaktion von M. truncatula auf Stress wurde auf physiologischer und metabolischer Ebene und mittels Proteinexpression untersucht. Die molekularen Mechanismen, die den Wasserhaushalt unter Trockenstress regulieren, sind von zentraler Bedeutung für die Pflanzenphysiologie. Massenspektrometriebasierte „shotgun-proteomics“ verwenden zur Identifizierung zumeist Proteindatenbanken, die durch Übersetzung von Nukleotidsequenzen erstellt werden. Dadurch besteht ein großer Engpass für nicht- bzw. unvollständig sequenzierte Organismen. Zusätzlich ist die funktionelle Charakterisierung vieler Sequenzen unvollständig. Annotationsinformationen wurden über automatisierte Methoden (Mercator) und BLAST Homologiesuchen von gut charakterisierten auf nicht bzw. schlecht charakterisierte Arten übertragen. Diese funktionellen Charakterisierungen wurden zur Gruppierung und zur Visualisierung von „omics“ Daten verwendet. Ein partielles 15N-Metabolitmarkierungsexperiment wurde zur Untersuchung des differentiell regulierten Wasserhaushalts mittels molekularer Mechanismen durchgeführt. Um komplexe zusammengesetzte Spektren zu extrahieren, die aufgrund von 15N-Anreicherung entstehen, wurde ein neuer Algorithmus entwickelt, der die Berechnung von Proteinumsatzraten ermöglicht.

Abstract

(Englisch)

Molecular Systems Biology aims to detect as many biochemical substances as possible utilizing and combining “omics” technologies. A specific part of this field of research focuses on the use of Mass Spectrometry for the detection of analytes in plants, such as primary and secondary metabolites as well as peptides and proteins. Specialized Mass Spectrometers, e.g. Triple Quadrupole or Linear Ion Trap/Orbitrap, can be utilized depending on the type of analyte and the focus of the research. In agreement with the instrument, corresponding data acquisition methods have to be applied. The generated data, depending on the acquisition method, can be large as well as complex, and its analysis necessitates the use of specialized computational methods. An unbiased LC/MS approach was developed for the detection of plant secondary metabolites from crude extracts of Arabidopsis thaliana. In order to link biochemical pathways, plant primary and secondary metabolomics data was integrated. LC/MS data acquisition methodology, data extraction and data analysis are discussed within this thesis. A Mass Spectrometry-based method for the absolute quantification of target proteins, termed Mass Western, is described, with particular regard to the choice of instrumentation. The latter was refined by the design of cross-concatenated standard peptides for exact stoichiometric quantification of protein complexes. Medicago truncatula, a sequenced model organism of legumes, has the capacity to exchange sugars for ammonium with nitrogen-fixing bacteria, a process known as Symbiotic Nitrogen Fixation (SNF). This process is significant for sustainable agricultural systems worldwide, as legumes are among the most important plant families to humans. SNF is susceptible to environmental stresses, particularly drought, which inhibits SNF and subsequently reduces crop yields. M. truncatula served to study physiological, metabolic as well as proteomic responses to drought stress. The molecular mechanisms regulating the differential control of water relations during drought is of fundamental importance to plant physiology. Mass Spectrometry-based shotgun-proteomics mostly relies on the transla159 tion of nucleotide to protein sequence databases for identification purposes. Therefore, a major bottleneck exists for un-sequenced or imperfectly sequenced organisms. Additionally, the functional characterization of many sequences is incomplete. Annotation information was transferred from well-characterized to un- or poorly-characterized species via automated pipelines (Mercator) and BLAST homology searches. These functional characterizations served to cluster detected compounds and to visualize omics data. A 15N partial metabolic labeling experiment was performed to study the molecular mechanisms regulating the differential control of water relations during drought. In order to extract complex spectral envelopes, arising due to the 15N incorporation, a novel algorithm, enabling protein turnover calculations, was developed.

Autor*innen

David Benjamin Lyon

Haupttitel (Englisch)

Computationally assisted mining and processing of proteomics data of Medicago truncatula under drought stress

Publikationsjahr

2014

Umfangsangabe

169 S. : graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Lennart Martens ,

Rainer Schuhmacher

Klassifikationen

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,

54 Informatik > 54.50 Programmierung: Allgemeines

AC Nummer

AC12145838

Utheses ID

31399

Studienkennzahl

UA | 794 | 685 | 437 |

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