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Epiplakin attenuates experimental pancreatitis in mice by chaperoning the disease-associated keratin reorganization

Karl Wögenstein

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

PhD-Studium (Doctor of Philosophy) (Dissertationsgebiet: Molekulare Biologie)

Betreuer*in

Peter Fuchs

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DOI

10.25365/thesis.35586

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29137.45261.767355-2

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

In früheren Arbeiten wurde gezeigt, dass Epiplakin, ein großes Mitglied der Proteinfamilie der Plakine, ausschließlich in Epithelien exprimiert wird und an Intermediärfilamente bindet. Die Analyse von Epiplakin defizienten (EPPK−/−) Mäuse offenbarte keinen offensichtlichen, spontanen Phänotyp. EPPK−/− Keratinozyten zeigten allerdings einen rascheren Zusammenbruch ihres Keratin Netzwerks nach Behandlung mit dem Phosphatase Inhibitor Okadasäure, was auf eine Funktion von Epiplakin in der Stressantwort hindeutete. Die Rolle von Epiplakin in einfachen Epithelien wurde bislang nicht aufgeklärt. Das Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss von Epiplakin auf das Pankreas, ein Organ welches hauptsächlich aus einfachen Epithelien besteht und starke Expression von Keratinen aufweist, aufzuklären. Zu diesem Zwecke wurde die Expression von Epiplakin im gesunden und entzündeten Pankreas analysiert. Weiters wurden Wildtyp und EPPK−/− Mäuse in Bezug auf ihre Empfindlichkeit für Caerulein-induzierte akute Pankreatitis verglichen. Zusätzlich wurde die Organisation der Keratin Netzwerke in Azinarzellen während des mit Pankreatitis einhergehenden Abbaus und Reorganisation der Keratin Filamente untersucht. Epiplakins molekularer Wirkungsmechanismus wurde durch ergänzende ex vivo Experimente mit primären Hepatozyten und in vitro Analysen mit aufgereinigten Keratinen und Epiplakin-Proteinfragmenten untersucht. Die Expression von Epiplakin wurde vorwiegend in Gangzellen des Pankreas detektiert. Zusätzlich wurde Epiplakin in murinen pankreatischen Azinarzellen gefunden in denen es mit apikolateralen Keratinbündeln kolokalisierte. Während akuter Pankreatitis kam es zur parallelen Hochregulation von Epiplakin und Keratin in Azinarzellen. Weiters war Epiplakin in diesen Zellen nicht mehr ausschließlich apikolateral sondern weiter verteilt im Zytoplasma zu finden, wo es mit Keratinfilamenten kolokalisierte, die ihrerseits eine umfangreiche Reorganisation durchmachten. Basierend auf histologischen und serologischen Parametern konnte gezeigt werden, dass EPPK−/− Mäuse an stärkerer experimentell induzierter Pankreatitis litten als ihre Wildtyp-Geschwister. Als mögliche Ursachen für den beobachteten Phänotyp konnten eine veränderte Größe und Lokalisation von Zymogengranula sowie eine gestörte Sekretion von Verdauungsenzymen ausgeschlossen werden. Interessanterweise zeigten EPPK−/− Azinarzellen während einer Pankreatitis eine erhöhte Anzahl an aggregierten Keratinen, was auf eine gestörte Keratin-Reorganisation hindeutete. Im Einklang damit, wurde nach artifizieller Überexpression von Keratin 8 in primären EPPK−/− Hepatozyten eine erhöhte Zahl von Keratin-Aggregaten in Kombination mit Zelltod detektiert. Dieser Phänotyp konnte durch die Inkubation mit dem chemischen Chaperon Trimethylamin-N-oxid aufgehoben werden, was auf eine Chaperon-ähnliche Funktion von Epiplakin für Keratine hinweist. Auf eine mögliche Rolle von Epiplakin in der Verhinderung der Ausbildung von Keratinaggregaten wurde auch durch in vitro Co-Sedimentations Experimenten hingewiesen, in denen durch Zugabe von Epiplakin-Proteinfragmenten die Löslichkeit von Keratin erhöht werden konnte. Meine Daten zeigen, dass Epiplakin während akuter Pankreatitis eine schützende Funktion ausübt. Vermutlich wird dieser Schutz dadurch erreicht, dass Epiplakin die durch Stress induzierte Keratin Reorganisation unterstützt und die Aggregation von Keratinen verhindert. Experimente mit dem chemischen Chaperon Trimethylamin-N-oxid deuten auf einen Zusammenhang zwischen der Aggregation von Keratinen und Zelltod hin, der die erschwerte Caerulein-induzierte Pankreatitis in EPPK−/− Mäusen erklären könnte.

Abstract

(Englisch)

Epiplakin, a giant member of the plakin protein family, is exclusively expressed in epithelial tissues and was shown to bind to keratin. Epiplakin-deficient (EPPK−/−) mice did not display any obvious spontaneous phenotype. EPPK−/− keratinocytes however, showed faster keratin network breakdown in response to treatment with phosphatase inhibitors, suggesting a function for epiplakin in stress response. The role of epiplakin in simple epithelia was elusive. In this work, I aimed to reveal the importance of epiplakin in the pancreas, an organ consisting primarily of simple epithelial tissue with abundant keratin expression. To this cause, I analyzed epiplakin’s expression in healthy and inflamed pancreatic tissue and compared wild-type and EPPK−/− mice during caerulein-induced acute pancreatitis. Additionally, using immunofluorescence microscopy, I monitored the disassembly and reorganization of keratins during the course of pancreatitis. To elucidate epiplakin’s molecular mode of action, complementary ex vivo experiments using primary hepatocytes and in vitro assays with purified keratins and truncated epiplakin protein were performed. Epiplakin was found to be expressed primarily in ductal cells of the pancreas and to colocalize with apicolateral keratin bundles in murine pancreatic acinar cells. During acute pancreatitis, parallel upregulation of epiplakin and keratin was detected in acinar cells. Furthermore, epiplakin lost its obligatory apicolateral localization and was found to be distributed throughout the cytoplasm of acinar cells, colocalizing with keratin filaments which underwent extensive reorganization during pancreatitis. EPPK−/− mice exhibited more severe pancreatitis than wild-type mice as shown both histologically and serologically. As potential causes for the observed phenotype aberrant zymogen granule size and localization as well as impaired discharge of digestive enzymes were ruled out. Interestingly, during acute pancreatitis more EPPK−/− than wild-type acinar cells displayed keratin aggregates, indicating impaired keratin reorganization in the absence of epiplakin. Similar to findings in the pancreas, increased appearance of keratin aggregates and elevated cell death were found in EPPK−/− primary hepatocytes upon forced overexpression of keratin 8. Importantly, this phenotype could be rescued by the small chemical chaperone trimethylamine N-oxide (TMAO), indicating a keratin chaperone-like function of epiplakin in simple epithelia. The potential role of epiplakin in the prevention of insoluble keratin aggregate formation was further supported by data from in vitro co-sedimentation assays, in which the presence of truncated epiplakin proteins increased the solubility of keratins. My data show that epiplakin is a protective protein during acute pancreatitis, preventing the formation of keratin aggregates, probably by chaperoning keratins during stress conditions associated with keratin upregulation and reorganization. Rescue experiments with the chemical chaperone trimethylamine N-oxide in primary hepatocytes revealed a correlation between the formation of keratin granules and cell death, providing a possible explanation for the increased severity of caerulein-induced pancreatitis in EPPK−/− mice.

Autor*innen

Karl Wögenstein

Haupttitel (Englisch)

Epiplakin attenuates experimental pancreatitis in mice by chaperoning the disease-associated keratin reorganization

Paralleltitel (Deutsch)

Epiplakin verringert den Schweregrad von experimentell-induzierter Pankreatitis in Mäusen durch Unterstützung der krankheitsbedingten Reorganisation des Keratin Netzwerks

Publikationsjahr

2014

Umfangsangabe

XV, 130 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Leopold Eckhart ,

Roland Foisner

Klassifikationen

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,

42 Biologie > 42.15 Zellbiologie

AC Nummer

AC12226353

Utheses ID

31537

Studienkennzahl

UA | 094 | 490 | |

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