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Bioaktivitätsgeleitete Isolierung von immunsuppressiven Substanzen aus Viola odorata L.
Katrin Pummer
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Diplomstudium Pharmazie
Betreuer*in
Gottfried Reznicek
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29316.93442.452765-6
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Im Rahmen der Untersuchung bezüglich einer immunsuppressiven Wirkung von Zyklotiden aus Violaceen stießen Dr. Gründemann und Dr. Gruber auf eine wirksame Fraktion von Viola odorata, die allerdings keine Zyklotide enthielt. Ziel dieser Diplomarbeit war es nun, die Wirkkomponente dieser Fraktion zu identifizieren. Dazu wurde die Droge mit der leicht abgeänderten Extraktionsmethode nach Hellinger et al. (2013) extrahiert. Das Lyophilisat wurde anschließend mittels Festphasenextraktion mit C18-modifiziertem Kieselgel (SPE C18) aufgereinigt, und die dabei erhaltenen Fraktionen zur Testung nach Freiburg geschickt. Anzumerken ist, dass während der Aufreinigung ein Dihydroxycumarin angereichert wurde, das in der Originalfraktion, welche mittels präparativer Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) gewonnen wurde, nicht enthalten war. Der Grund für diese Anreicherung bzw. das Fehlen dieser Substanz in der Originalfraktion konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht geklärt werden.
Nach der Ermittlung der wirksamen Fraktionen wurden der Extraktionsprozess und die SPE C18 insgesamt viermal wiederholt. Um die dabei erhaltenen wirksamen Fraktionen in ihre Einzelkomponenten auftrennen zu können, wurde anschließend eine Methode entwickelt. Bei dieser wurde zunächst das angereicherte Dihydroxycumarin mittels Kieselgel-Festphasenextraktion abgetrennt, um danach die Fraktion mittels einer Aminopropyl-Kieselgel-Festphasenextraktion in ihre Einzelkomponenten auftrennen zu können. Mit Hilfe dieser entwickelten Methode wurden die Substanzen „KP01“ (2,01 mg), „KP02“ (7,55 mg) und „KP03“ (4,40 mg) isoliert, wobei es sich bei „KP03“ um keine der ursprünglichen Zielsubstanzen handelt, sondern um das angereicherte Dihydroxycumarin. Anschließend wurde bei den isolierten Substanzen mittels HPLC-CAD die Reinheit bestimmt und mittels Mehrstufen-MS mit Direktinfusion das Molekulargewicht und erste Strukturelemente erfasst. Danach wurde die Struktur der Substanzen mittels 1D-(1H, 13C) und 2D-NMR (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) bestimmt. Bei „KP03“ handelt es sich um das bekannte 6,7-Dihydroxycumarin. Bei „KP01“ und „KP02“ erwies sich die Strukturaufklärung schwieriger. Gesichert ist, dass beide Verbindungen ein Cumaringrundgerüst aufweisen, welches an den Positionen 5, 6, 7 und 8 substituiert ist. Bei den Substituenten handelt es sich um zwei Methoxygruppen und zwei Hydroxygruppen, wobei eine der Hydroxygruppen eine O-glykosidisch gebundene Hexose trägt. Bei der Hexose handelt es sich nach Recherche in bestehender Literatur höchstwahrscheinlich um eine ß-D-Glucose. Die exakte Stellung der Substituenten konnte aufgrund der großen Anzahl an quartären C-Atomen bei „KP01“ allerdings nicht ermittelt werden. Es handelt sich wahrscheinlich um ein 5,8-dihydroxy-6,7-dimethoxycumarin-8-ß-glucopyranosid. Bei „KP02“ sind zusätzlich die Position der Hexose und der Methoxygruppe, welche an Position sechs gebunden ist, gesichert. Es handelt sich daher bei „KP02“ mit ziemlicher Sicherheit um ein 5,8-dihydroxy-6,7-dimethoxycumarin-5-ß- glucopyranosid.
Nachdem die Struktur der Verbindungen weitestgehend aufgeklärt werden konnte, werden die isolierten Verbindungen in einem nächsten Schritt in der Uniklinik Freiburg einer Bioaktivitätstestung unterzogen.
Dieser Arbeit liegt ein Multimedia-Anhang bei.
Abstract
(Englisch)
Dr. Gründemann and Dr. Gruber found out, that cyclotides (Gründemann et al., 2013) and cyclotide-containing extracts from Oldenlandia affinis (Gründemann et al., 2012) show an immunosuppressive effect on primary lymphocytes. Considering that plants of the genus Viola contain cyclotides too, the next step was to investigate extracts from Viola tricolor (Hellinger et al., 2013) and Viola odorata. During this investigation they separated a fraction, which had an in vitro immunosuppressive effect, though didn’t contain cyclotides. This is where this diploma thesis draws on, whose target was to find the active component of this fraction. First of all, the drug was extracted with an extraction method derived from Hellinger et al. (2013). Afterwards, the obtained lyophilised extract was pre-purified with C18 solid-phase extraction (SPE C18) and the resulting fractions were sent to Freiburg for activity testing. It should be noted, that in contrary to the original fraction, which was obtained by preparative high-performance liquid chromatography (HPLC) in the group of Dr. Gruber, these fractions contained a dihydroxycoumarin, which was accumulated during the extraction. Neither the reason of this accumulation nor the reason of absence in the original fraction could be worked out in this thesis.
After identification of the active fractions, the extraction process and the SPE C18 were repeated four times and a method for the separation of these fractions was developed. First of all, a silica gel solid-phase extraction was carried out to separate the dihydroxycoumarin. Afterwards, the active fractions were separated in individual components with aminopropyl solid-phase extraction. As a result, three components, „KP01“ (2.01 mg), „KP02“ (7.55 mg) and „KP03“ (4.40 mg), were isolated and the purity of these components was determined by HPLC-CAD. Subsequently, the molecular weight and some elements of the chemical structure were determined by direct infusion mass spectrometry, which supported the structure elucidation by NMR spectroscopy. “KP03” isn’t one of the targeted components, but the accumulated coumarin, which proved to be a 6,7-dihydroxycoumarin. The structure elucidation of “KP01” and “KP02” was much more difficult. They were determined to be 5,6,7,8-tetraoxygenated coumarins. Two of the substituents are methoxy groups and the other ones are hydroxy groups, one of them carrying a hexose. A literature research regarding the hexose showed that it is most likely a ß-D-glucose.
The exact position of the substituents in “KP01” couldn’t be determined due to the high number of quarternary carbons, but it is most probably a 5,8-dihydroxy-6,7- dimethoxycoumarin-8-ß-glucopyranoside.
For “KP02” the position of the hexose and the methoxy group in position six were proven. Thus, “KP02” is very likely a 5,8-dihydroxy-6,7-dimethoxycoumarin-5-ß- glucopyranoside.
After the structure of the isolated compounds was mostly elucidated, they were sent to Freiburg for bioactivity testing.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Viola odorata immunsuppressiv Cumarin
Autor*innen
Katrin Pummer
Haupttitel (Deutsch)
Bioaktivitätsgeleitete Isolierung von immunsuppressiven Substanzen aus Viola odorata L.
Publikationsjahr
2015
Umfangsangabe
117 S.
Sprache
Deutsch
Beurteiler*in
Gottfried Reznicek
AC Nummer
AC12215385
Utheses ID
31621
Studienkennzahl
UA | 449 | | |