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siRNA-basierte Evaluierung von Heat Shock Proteinen als Ziele in der Tumortherapie

Kathrin Laczkovits

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Diplomstudium Pharmazie

Betreuer*in

Ernst Urban

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DOI

10.25365/thesis.35708

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-30107.96863.362459-6

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Unter RNA-Interferenz versteht man einen sequenzspezifischen, post-transkriptionellen Gen-Silencing-Mechanismus, welcher durch dsRNA vermittelt wird. Speziell in letzter Zeit gibt es zunehmendes Interesse an der Nutzung dieser Gen-Silencing-Aktivität, um neue Medikamente für die Behandlung verschiedener Krankheiten zu entwickeln. Krebs gilt dabei als eines der Hauptziele, da Onkogene, mutierte Tumorsuppressorgene und mehrere andere Gene, welche zur Tumorprogression beitragen, potentiell wichtige Ziele für das Gen-Silencing durch RNAi sind. SiRNA-basierte Medikamente haben deutliche Vorteile gegenüber herkömmlichen kleinen Molekülen oder Protein-basierten Medikamenten, darunter zum Beispiel hohe Spezifität, bessere Wirksamkeit und geringere Toxizität. Einen weiteren großen Vorteil der RNAi-Therapeutika bei Krebs stellt das gleichzeitige Erreichen mehrerer Gene dar. Allerdings gibt es einige technische Hürden zu überwinden, welche sich im Fokus der aktuellen Forschung und Entwicklung befinden. Da Heat Shock Proteine in Krebszellen häufig überexprimiert sind und dadurch zur Stabilisierung onkogener Proteine führen sowie das Überleben der Tumorzellen, die Proliferation, die Gefäßneubildung und die Metastasierung fördern, wurde in dieser Diplomarbeit untersucht, ob und welche Heat Shock Proteine günstige therapeutische Ziele von Tumortherapeutika sind. Ausgewählte synthetische siRNAs von Heat Shock Proteinen (HSP27, HSP60, HSP90, CDC37, GRP58, GRP78) wurden in MDA-MB-468- sowie in A549-Zellen transfiziert. Anhand von Proliferationstest wurden die verschiedenen Effekte der einzelnen siRNAs auf das Wachstum der Krebszellen gezeigt. Die stärkste proliferationshemmende Wirkung hatte demnach die siRNA gegen CDC37 sowohl in den MDA-MB-468- als auch in den A549-Zellen. Durch spezielle Kombinationen mit bestimmten anderen siRNAs bzw. auch miRNAs ließen sich die wachstumshemmenden Effekte mancher siRNAEinzelbehandlungen leicht steigern. Darunter war die Kombination von der siRNA gegen GRP58 und Lin28b sowie die Mischung von miR-29b und HSP27. Bei anderen, besonders mit der siRNA gegen HSP60 wurde jedoch eine deutliche Reduktion der proliferationshemmenden Wirkung festgestellt. Der Einfluss der Einzel- sowie Kombinationsbehandlung mit verschiedenen siRNAs auf die einzelnen Zellzyklusphasen der MDA-MB-468 bzw. A549-Zellen wurde mit Hilfe der Durchflusszytometrie untersucht. Dabei erwies sich in den MDA-MB-468-Zellen die Einzelbehandlung mit den siRNAs gegen GRP78 bzw. HSP90 sowie die siRNAKombinationsbehandlung gegen GRP78 und HSP90 mit einer deutlichen Verschiebung der G0/G1-Phase zur G2/M-Phase am effektivsten. In den A549-Zellen konnte der deutlichste Effekt nach Survivin-Knockdown mit einer starken Abnahme des Zellanteils in der G0/G1-Phase festgestellt werden, wogegen der apoptotische Zellanteil erhöht war. Generell konnte gezeigt werden, dass sich das Tumorwachstum nicht durch jede Heat Shock Protein-siRNA oder spezielle Kombinationen im gleichen Ausmaß hemmen lässt, wodurch die Bedeutung einer Definition effektiver Zielgen-Kombinationen in der Tumortherapie in Abhängigkeit der einzelnen Krebsarten verdeutlicht wird.

Abstract

(Englisch)

RNA interference is defined as a sequence-specific, post-transcriptional gene silencing mechanism mediated by dsRNA. Especially in the last years there has been increasing interest to use this gene-silencing-activity in order to develop new drugs for the therapy of various diseases. Cancer is regarded as one of the major targets, as oncogenes, mutated tumor suppressor genes and several other genes that contribute to tumor progression, are potentially important targets for gene silencing by RNAi. SiRNA-based drugs have many advantages in contrast to conventional small molecules or proteinbased drugs, including high specificity, better efficacy and less toxicity. The simultaneous knockdown of several genes is another great advantage of RNAi therapeutics in cancer. However, there are some technical barriers to overcome, which are the focus of current research and development. As heat shock proteins are often overexpressed in cancer cells and thus stabilize oncogenic proteins, promote tumor cell survival, proliferation, angiogenesis and metastasis, in this thesis the main focus was on the investigation of heat shock proteins as favourable targets of anticancer-therapeutics. Selected synthetic siRNAs targeted at heat shock proteins (HSP27, HSP60, HSP90, CDC37, GRP58, GRP78) were transfected into MDA-MB-468- and A549 cells. Based on proliferation assays the different growth-inhibiting effects of these siRNAs were analyzed. In both celllines siRNA against CDC37 had the most obvious proliferationinhibiting effect. Using special combinations with other siRNAs or miRNAs the growthinhibitoring effects of some siRNA-single treatments could be slightly increased. Among them was the siRNA against GRP58 and Lin28b as well as the combination of miR-29b and HSP27. In other combinations however, especially with the siRNA against HSP60, a significant reduction in the anti-proliferative effect was observed. The influence of single and combination treatment with various siRNAs on the individual cell cycle phases of MDA-MB-468 and A549 cells was analyzed by flow cytometry. In the MDA-MB-468 cells it turned out that the single treatment of the siRNA against GRP78 and HSP90 and the siRNA-combination treatment against GRP78 and HSP90 was most effective with a significant shift of the G0/G1-phase to the G2/M-phase. In A549 cells the most obvious effect was after survivin-knockdown with a strong decrease of the cell content in the G0/G1-phase, whereas the apoptotic cell percentage was increased. Generally it has been shown that tumor growth is not inhibited by any heat shock protein-siRNA or specific combinations to the same extent, which clarifies the importance to define effective target gene-combinations in tumor therapy in dependence of the various forms of cancer.

Autor*innen

Kathrin Laczkovits

Haupttitel (Deutsch)

siRNA-basierte Evaluierung von Heat Shock Proteinen als Ziele in der Tumortherapie

Paralleltitel (Englisch)

siRNA-based evaluation of heat shock proteins as therapeutic cancer targets

Publikationsjahr

2015

Umfangsangabe

62 S.

Sprache

Deutsch

Beurteiler*in

Ernst Urban

Klassifikation

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.99 Naturwissenschaften allgemein: Sonstiges

AC Nummer

AC12216543

Utheses ID

31645

Studienkennzahl

UA | 449 | | |

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