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Heads decide: Structural and functional characterization of selected plectin isoform-specific sequences

Julius Kostan

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

PhD-Studium (Doctor of Philosophy) (Dissertationsgebiet: Molekulare Biologie)

Betreuer*in

Gerhard Wiche

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DOI

10.25365/thesis.35784

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29931.74578.114269-9

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Plektin ist ein großes und höchst vielseitiges Protein, welches Aktin, Tubulin und einige andere Intermediärfilamente querverlinkt, und dadurch einen großen Einfluss auf die zeitlichen und örtlichen Arragements und Dynamiken nimmt. Aufgrund von alternativem Splicing wird Plektin in verschiedenen Isoformen exprimiert, die sich im N-terminalen Bereich unterscheiden, welcher wiederum die subzelluläre Verwendungsstellen diktiert. Allerdings versteht man die Mechanismen noch wenig, wie der N-terminale Bereich dieses riesige Protein zu verschiedenen Orten und/oder Bindungspartner dirigiert und dadurch die Funktion abstimmt; und diese Mechanismen müssen dementsprechend noch aufgeklärt werden. Um nun die strukturellen Eigenschaften von Plektin Isoformen 1a- und 1c-spezifischen Sequenzen zu untersuchen und diese in Verbindung mit ihrer Funktion zu bringen, haben wir Methoden zur Aufreingung von Plektinfragmenten etabliert, bestehend aus diesen Sequenzen fusioniert mit der ABD von Plektin oder mit längeren N-terminalen Bereichen von Plektin, unter anderem mit dessen Plakin Domäne. Die Kristallisation dieser Fragmente war nicht erfolgreich, was darauf hindeutet, dass die für Plektin Isoformen 1a und 1c spezifischen Sequenzen sehr flexible oder ungeordnet sind, zumindest im ungebundenen Zustand. Im zweiten Teil wurden biochemische und zellbiologische Herangehensweisen benutzt, um neue Bindungspartner zu identifizieren, die bevorzugt an den N-terminalen Teil binden. Eines der beiden neu identifizierten Bindungspartnern, Vimentin, ein Intermediärfilament, bindet den N-terminalen Bereich der ABD von Plektin in seiner löslichen tetrameren Form. Zusätzlich wurde eine isoformspezifische Interaktion von Plektin mit Calmodulin, ein Ca2+ wahrnehmendes Protein, charakterisiert. Wir zeigen, dass Calmodulin an die CH1 Domäne von Plektin Isoform 1a in einer Ca2+ abhängigen Weise bindet. Weiters wurde gezeigt, dass die Bindung von Calmodulin/Ca2+ an Plektin seine Bindung an F-Aktin und Integrin β4 verhindert. Interessanterweise spielt die Interaktion von Integrin α6β4 mit Plektin eine große Rolle in der Ausbildung von Hemidesmosomen, das sind Adhäsionskomplexe multipler Proteine, die Epithelzellen mit der basalen Matrix verbinden. Darüberhinaus war die bisher gängige Meinung zur Loslösung der Epithelzellen von der basalen Matrix während der Wundheilung und die Differenzierung von Keratinozyten, welche die Disassemblierung der Hemidesmosomen benötigen, dass diese nur durch Phosphorylierung von Integrin β4 durch Proteinkinasen bewerkstelligt werden. Unsere Resultate erlauben uns ein neues Modell für die Disassemblierung der Hemidesmosomen während der Differenzierung der Keratinozyten vorzuschlagen, welches sowohl die Bindung von Calmodulin an Plektin 1a als auch die Phosphorylierung von Integrin β4 benötigt, um den Komplex von Integrin α6β4 mit Plektin unterbricht.

Abstract

(Englisch)

Plectin is a large and highly versatile cytolinker protein, which cross-links actin, tubulin, and various intermediate filament proteins, having a great impact on their spatial-temporal arrangements and dynamics. Due to alternative splicing, plectin is expressed as various isoforms with differing N-terminal heads, which dictate subcellular targeting of the protein. However, detailed mechanism(s) how plectin’s heads direct the giant protein to different location and/or binding partners and thus modulate its function is not well understood yet, and needs to be, elucidated. To investigate structural properties of plectin 1a and plectin 1c isoform specific sequences and relate them to their function, we established method(s) for purification of tagged and un-tagged plectin fragments comprising these sequences fused to plectin’s ABD or to longer N-terminal parts of plectin including its plakin domain as well. Crystallization of these fragments was not successful, and indicated that plectin 1a and plectin 1c isoform specific sequences might be highly flexible or disordered, at least in their unbound state. In the second part biochemical and cell biological approaches were used to identify novel binding partners of plectin interacting preferentially with its N-terminal part. Of the two novel binding partners identified, vimentin, an intermediate filament protein, was found to interact with the N-terminal part of plectin’s ABD in its soluble “tetrameric” form. In addition, isoform specific interaction of plectin with calmodulin, a Ca2+-sensing protein, has been characterized. Calmodulin was showed to bind to the CH1 domain of plectin 1a in a Ca2+- and isoform-dependent fashion. Furthermore, binding of Ca2+/calmodulin to plectin 1a was found to prevent its binding to F-actin, and integrin β4. Interestingly, the interaction of integrin α6β4 with plectin 1a plays a major role in the formation of hemidesmosomes, multiprotein adhesion complexes, connecting epithelial cells to the basal matrix. Moreover, the detachment of epithelial cells from the basal matrix during wound healing and differentiation of keratinocytes requires the disassembly of the hemidesmosomal complexes, which formerly was believed to be mediated only by phosphorylation of integrin β4 by protein kinases. Thus our results allowed us to propose a novel model for the disassembly of hemidesmosomes during keratinocyte differentiation, where both, binding of calmodulin to plectin 1a and phosphorylation of integrin β4, are required for disruption of the integrin α6β4- plectin complex.

Autor*innen

Julius Kostan

Haupttitel (Englisch)

Heads decide: Structural and functional characterization of selected plectin isoform-specific sequences

Paralleltitel (Deutsch)

Strukturelle und funktionelle Charakterisierung von ausgewählten Plektin-isoformspezifischen Sequenzen

Paralleltitel (Englisch)

Heads decide: Structural and functional characterization of selected plectin isoform-specific sequences

Publikationsjahr

2014

Umfangsangabe

II, 113 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Dieter D. Fürst ,

Lars Backmann

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC12200617

Utheses ID

31713

Studienkennzahl

UA | 094 | 490 | |

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Schlagwörter