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Enhancement of orthopaedic gene therapy
Ara Hacobian
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
PhD-Studium (Doctor of Philosophy) (Dissertationsgebiet: Molekulare Biologie)
Betreuer*in
Heinz Redl
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29068.97748.191865-9
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Eine der Hauptkomponenten der Gewebezüchtung beinhaltet die Anwendung von gewebespezifischen Wachstumsfaktoren entweder auf Proteinebene oder kodiert auf einem theraoeutischen DNA-Plasmid (Gentherapie).
Die Anwendung von therapeutischen Plasmiden kodierend für Wachstumsfaktoren bietet ein vielverpsrechendes Mittel verbunden mit niedrigen Herstellungskosten, höherer Sicherheit und erhöhte Bioaktivität der produzierten Proteine wegen wirtsspezifischer post-translationaler Modifikationen und korrekter Faltung der lokal produzierten Wachstumsfaktoren. Um exogene DNA in Zielzellen (sowohl in vitro als auch in vivo) einzubringen, können mehrere virale oder nicht-virale Gentransfer-Methoden angewendet werden. Jedoch sind nicht-virale Methoden in ihrer Effektivität beschränkt. Trotzdem punkten nicht-virale Transfersysteme durch niedrige Produktionskosten, leichter Anwendbarkeit und Sicherheit. Deshalb sind viele Versuche laufend, die auf spezifische Modifikationen der Transfersysteme oder durch das Zufügen von Helfersubstanzen (z.B Peptide), um die Wirksamkeit des nicht-viralen Gentransfers zu erhöhen, als viralen Gentransfer sicherer zu machen.
Aus diesen Gründen wurden in dieser Arbeit Methoden vorgestellt um einen schwachen Gentransfer, oder die Effizienz der Genexpression, zu verbessern um die schwache Wirksamkeit zu kompensieren. Erstens wurde die hämolytische Aktivität verschiedener, auf Virulenzfaktoren basierender Peptide miteinander verglichen. sogenannte endosomolytischen Peptide mediieren die Zerstörung der Lysosomenmembran während des Gentransfers und verhindern dadurch den Abbau des Gentransfersystems sowie der therapeutischen DNA.
Weiters wurden Strategien entwickelt, um die Genexpression an sich zu erhöhen, um einen eventuellen schlechten Gentransfer vorzubeugen, unter anderem Modifikationen am Promotersystem der Expressionskasette (Kaskadenpromoter).
Weiters wurde die Stärke von Sekretionssignalen von unterschiedlichen Protein verglichen, um eventuell schwache Signalsequenzen der eingesetzten Wachstumsfaktoren mit potenteren zu ersetzen. Dabei wurden unter anderem auch interessante Engpässe in der Proteinsekretion beobachtet und analysiert.
Letztendlich wurden auch im Fall der Knochenregeneration Strategien vorgestellt, um nicht-virale Anwendungen der Gentherapie speziell in diesem Fall (osteogene Differenzierung) zu verbessern. Unter anderem der Einsatz und Verifizierung von Hybridplasmiden, konzipiert für eine transiente Überexpression eines knochenspezifischen Wachstumsfaktors bei gleichzeitiger erzwungener Unterdrückung (Herunterregulierung) von potentiellen Inhibitoren des osteogenen Signalweges.
Abstract
(Englisch)
One of the key components of tissue engineering is the delivery of tissue specific growth factors either as protein level or encoded on therapeutic DNA plasmids (gene therapy).
The application of therapeutic plasmids encoded for growth factors provides a promising tool associated with lower manufacturing costs, higher safety and increased bioactivity of the produced proteins due to host-specific post-translational modifications and correct folding of the locally produced growth factors. In order to introduce exogenous DNA into cells in vitro and in vivo, several strategies based on viral or non-viral gene transfer approaches can be applied. Unfortunately, non-viral gene transfer methods are limited in their efficacy. Nevertheless, non-viral vectors score concerning their manufacturing cost, easy handling and safety. Therefore, many attempts are ongoing to increase the efficacy of gene delivery using non-viral vectors by specific modifications or additional auxiliary substances, than trying to make viral systems safer. Therefore, in this work, different strategies are introduced to compensate weak gene delivery. Firstly, hemolytic activity of different viruence-factor derived peptides were compared for their potency to enhance in gene transfer systems as mediating disruption of lysosomes.
Compared to other tested endosomolytic peptides, the virulence-factor Listeriolysin O showed unrivalled pH specific hemolytic activity. Secondly, strategies to enhance gene expression itself were introduced in order to compensate weak transfection efficiency. Sequence modifications of the therapeutic gene showed several fold increase in gene expression. Additionally, by constructing a cascade promoter system, bottlenecks of transfection factor depletion was overcomed, leading to further increase in expression. Thirdly, screening of potent secretion signal sequences to mediate enhanced protein secretion by signal sequence exchange was performed. Additionally, by monitoring protein secretion kinetics intersting insights into bottlenecks during protein secretion were observed. Finally, additional strategies to improve specifically osteogenic differentiation. Amongst others, the application of a hybrid vector system for overexpression of a therapeutic gene by simulatenous downregulation of inhibitory factors showed enhanced osteogenic differentiation of target cells compared to conventional vectors.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
osteogenic differentiation gene therapy bone gene expression non-viral mirna sirna secretion signal bone morphogenetic protein
Schlagwörter
(Deutsch)
osteogene Differentierung Gentherapie Knochen Genexpression nicht-viral mirna sirna Sekretionssignal Knochenmorphogenes Protein
Autor*innen
Ara Hacobian
Haupttitel (Englisch)
Enhancement of orthopaedic gene therapy
Paralleltitel (Deutsch)
Verbesserung orthopädischer Gentherapie
Publikationsjahr
2014
Umfangsangabe
108 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Anthony McHale ,
Johann Wojta
AC Nummer
AC12205344
Utheses ID
32195
Studienkennzahl
UA | 094 | 490 | |