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Establishment of a high-throughput screen selecting for thermostable mutants of an Escherichia coli dipeptide transporter
Elisabeth Malle
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Peggy Stolt-Bergner
DOI
10.25365/thesis.3674
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29072.93679.291069-3
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Jede lebende Zelle ist von einer semipermeablen Membran umgeben, die sie von ihrer Umwelt abgrenzt. Diese Abgrenzung verlangt das Vorhandensein von Systemen, durch die Zellen mit ihrer Umgebung kommunizieren können. Essentielle biologische Funktionen wie zum Beispiel Signaltransduktion, Metaboliten- und Ionenhomöostase und Energieproduktion werden von integralen Membranproteinen ausgeführt. Eine spezielle Art von Membranproteinen sind sogenannte sekundäre Transporter, die für die Aufnahme von Nährstoffen in die Zelle verantwortlich sind. Zusätzlich transportieren diese Proteine eine Vielzahl von Wirkstoffen. Ein wichtiger Schritt, um die Funktion und die Mechanismen eines biologischen Makromoleküls besser zu verstehen, ist die Aufklärung der Proteinstruktur. Da die Kristallisation von Membranproteinen sehr anspruchsvoll und mühsam ist, gibt es nur sehr wenige Röntgenstrukturen von sekundären Transportern. Eine neuartige Verfahrensweise, in der die thermische Stabilität eines Proteins erhöht wird, erleichtert die Kristallisation. In diesem Projekt wurde ein einfacher und schneller „high-throughput“ Screen entwickelt, um thermostabilere Mutanten des Escherichia coli Dipeptidtransporters YdgR zu identifizieren. Der Screen selbst besteht aus zwei Schritten. Der erste trennt funktionelle Transportermutanten von inaktiven Mutanten, im zweiten Schritt werden die mutierten Proteine aufgereinigt, und deren Stabilität wird mittels static light scattering (statische Lichtstreuung) bestimmt. Funktionale und strukturelle Studien an Wildtyp- und Mutantenproteinen sollen einen detailierteren Einblick in den Mechanismus des Peptidtransports geben. Die hier entwickelte Strategie ist ein vielversprechendes Werkzeug, welches auch an anderen Proteinen anwendbar ist, und somit helfen könnte, die Anzahl an gelösten Membranproteinstrukturen zu erweitern.
Abstract
(Englisch)
All cells are separated from their environment by semipermeable membranes. This division demands the presence of systems with which cells can communicate with their surroundings. Integral membrane proteins carry out essential biological functions including signal transduction, metabolite and ion homeostasis and energy production. Secondary transporters are one kind of membrane protein that facilitate uptake of nutrients into a cell. Furthermore, they transport a vast number of drugs. Determining the structure of a biological macromolecule is a crucial step towards the understanding of its function and mode of operation. Very few X-ray structures of secondary transporters are available since crystallization of membrane proteins is a highly challenging endeavour. A novel approach to facilitating crystal growth is to enhance the thermal stability of a protein. Here, an easy and fast high-throughput screen was developed in order to identify thermostable variants of the Escherichia coli dipeptide transporter YdgR. In a first step, the screen distinguishes between active transporters and loss-of-function mutants. Second, the mutant transporter proteins are high-throughput purified, and their thermal stability is determined by static light scattering. Functional and structural studies on both the wildtype and mutant proteins should yield a more detailed insight into the mechanism of peptide transport. This promising strategy should be widely applicable to other proteins, and could be a very useful tool to boost the number of solved membrane protein structures.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
YdgR tppB secondary dipeptide transporter crystallization high-throughput screen
Schlagwörter
(Deutsch)
YdgR tppB sekundaerer Dipeptidtransporter Kristallisation High-throughput Screen
Autor*innen
Elisabeth Malle
Haupttitel (Englisch)
Establishment of a high-throughput screen selecting for thermostable mutants of an Escherichia coli dipeptide transporter
Paralleltitel (Deutsch)
Etablierung eines high-throughput Screens zur Identifizierung von thermostabilen Mutanten eines Escherichia coli Dipeptidtransporters
Publikationsjahr
2009
Umfangsangabe
XV, 80 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Peggy Stolt-Bergner
Klassifikation
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines
AC Nummer
AC08024018
Utheses ID
3228
Studienkennzahl
UA | 490 | | |