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Generation of an influenza A based therapeutic human papillomavirus type 16 vaccine
Christoph Jindra
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Dr.-Studium der Naturwissenschaften Molekulare Biologie
Betreuer*in
Reinhard Kirnbauer
DOI
10.25365/thesis.36600
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29153.98744.275762-6
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Das Zervixkarzinom ist weltweit die zweithäufigste Todesursache durch Krebserkrankungen der Frau. Die persistierende Infektion mit einem von etwa fünfzehn hoch-Risiko humanen Papillomviren (HPV), insbesondere HPV 16 oder 18, ist für die Entwicklung aller Zervix- und der meisten Analkarzinome, sowie eines Teils der Penis-, Vulva-, Vagina- und Oropharynxkarzinome verantwortlich. Obwohl die zugelassenen prophylaktischen HPV Vakzinen mit hoher Effizienz neue Infektionen verhindern, besteht kein therapeutischer Effekt auf bestehende Infektionen und induzierte Läsionen. Aufgrund der hohen Prävalenz (ca. 10%) von genitalen HPV Infektionen in der Bevölkerung sind effiziente therapeutische Impfstoffe wünschenswert, um bestehende Infektionen und daraus resultierende intraepitheliale Neoplasien zu reduzieren. HPV-induzierte neoplastische Zellen exprimieren die viralen Onkogene E6 und E7, welche daher mögliche Zielantigene für die Induktion einer effizienten Immunantwort darstellen.
In dieser Arbeit wurde eine therapeutische HPV 16 Vakzine auf Basis attenuierter Influenza A Virus-Vektoren generiert welche über Vorteile wie hohe Immunogenität, verschiedene Serotypen für multiple Immunisierungen, sowie das Fehlen von DNS Zwischenstufen verfügt. Letzteres wird als wichtiger Sicherheitsfaktor für eine Lebendvakzine angesehen.
Es wurde ein HPV 16 E6E7 Fusionskonstrukt (16E6E7FL) generiert und in den delNS1 Locus des Influenza A Genoms kloniert. Wegen möglicher Sicherheitsbedenken wurde eine weitere Fusion generiert, in der kurze Sequenzen von E6 und E7 deletiert wurden (16E6E7mFL), um die biologische Aktivität dieser Onkogene zu unterbinden. Um die Expression der Fusionsproteine zu steigern, wurde außerdem die ‚donor‘ Spleißstelle von NS1 modifiziert. Daraus resultierten insgesamt vier verschieden Influenza A Viren, da jeweils zwei unterschiedliche Serotypen, H1N1 und H3N2, als Vakzine generiert wurden.
Nach Infektion von Vero-Zellen für 12 Stunden mit rekombinanten Influenzaviren konnte die Expression von Transgen-mRNS mittels RT-PCR, und von Protein im Western Blot nachgewiesen werden. Die Fusionsproteine konnten erst durch die Verwendung eines Proteasomblockers (MG-132) detektiert werden, was auf eine rasche Degradation des Fusionsproteins durch inkorrekte Proteinfaltung hinweist.
Nachfolgend wurden C57BL/6 Mäuse mit hochtitrigen Influenzaviren mittels prime-boost Schema subkutan (s.c.) vakziniert und die generierte Immunantwort durch Peptid-ELISA, IFN-γ ELISpot und Proliferationsassays untersucht. Es konnte Peptid-spezifische IFN-γ Produktion in Splenozyten von vakzinierten Tieren nachgewiesen werden. Ebenso konnte Proliferation von Antigen-spezifischen CD4+ T-Zellen detektiert werden. Im ELISA konnten Antikörper gegen beide Influenza A Serotypen, aber nicht gegen HPV16 E6 oder E7 nachgewiesen werden. Allgemein wurden die Vakzinen gut vertragen und keines der Tiere zeigte erkennbare Zeichen von Toxizität.
Die prophylaktische und therapeutische Wirksamkeit der Vakzinen wurde anhand eines in vivo Mausmodells analysiert, bei dem HPV16-transformierte TC-1 Tumorzellen für den Challenge verwendet wurden.
Tiere, die zweimal s.c. immunisiert und anschließend mit Tumorzellen s.c. injiziert wurden, entwickelten keine Tumoren oder wiesen deutlich verringertes Tumorwachstum auf, verglichen mit Placebo- oder Leervektor-behandelten Tieren. Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt, wenn Mäusen TC-1 Zellen s.c. injiziert wurden, diese am selben Tag mit rekombinanten H1N1 Viren geimpft und zehn Tage darauf mit dem analogen H3N2 Serotyp geboostet wurden. Es wurden auch unterschiedliche Administrationsrouten der Vakzine, im speziellen intranasal (i.n.) und intratumoral (i.t.), näher analysiert. Intratumorale Applikation induzierte vollständige Tumorregression in 25% der Tiere sowie eine reduzierte Wachstumsrate der TC-1 Tumoren in den weiteren Tieren, während die i.n. Route wegen Nebenwirkungen nicht weiter verfolgt wurde.
Diese Ergebnisse unterstützen rekombinante Influenzaviren als eine vielversprechende, neue Strategie, um therapeutische Impfstoffe gegen HPV Infektionen und dadurch induzierte Erkrankungen zu entwickeln.
Abstract
(Englisch)
Cervical cancer is the second largest cause of cancer deaths in women worldwide. Persistent infection with one of the about 15 known high-risk mucosal human papilloma virus (HPV) types, in particular HPV16 and HPV18, cause all cervical, most anal and a subset of penile, vulvar, vaginal and oropharyngeal cancers. The viral major oncogenes E6 and E7 are maintained and expressed in HPV-induced intraepithelial neoplasia and invasive cancer. Although prophylactic vaccines are a major accomplishment to protect against new infections, the high prevalence of HPV in the general population suggests the need for therapeutic vaccines to efficiently diminish viral burden and to treat patients with prevalent disease.
Here we show the generation of a live vector-based therapeutic HPV16 vaccine candidate. For this purpose we used a delNS1 influenza virus system which has the advantages of high immunogenicity, availability of different serotypes (H1N1, H3N2) for prime and booster immunizations and lack of DNA intermediates as important safety feature.
As target immunogen we generated an HPV16 E6-E7 fusion construct fused to an affinity (FLAG octapeptide) tag (16E6E7FL), which was cloned into the delNS1 locus. Two different serotypes of recombinant influenza viruses were generated by reverse genetics and transfection of Vero cells. For safety concerns a second fusion of the E6 and E7 oncogenes was generated, with short deletions that abrogate biological functions (16E6E7mFL). To enhance protein expression the splice donor site for the fusion was further modified. Following viral infection of Vero cells for 12 hours (h), mRNA and fusion protein expression were verified by RT-PCR and Western Blot, respectively. Protein expression was only detected in the presence of the proteasome inhibitor MG-132, suggesting rapid degradation of the artificial E6-E7 fusion protein due to impaired folding.
The immune response to recombinant viruses was characterized by subcutaneous (s.c.) infection of C57BL/6 mice followed by HPV16 E6 and E7 peptide ELISA, IFN-γ ELISpot and T-cell proliferation experiments. In general the vaccines were well tolerated and mice showed no detectable signs of toxicity. Immune characterization showed peptide specific IFN-γ production by cytotoxic T lymphocytes of vaccinated mice and proliferation of antigen specific CD4+ T cells. ELISA experiments detected antibodies to either influenza A serotype but not to HPV16 E6 or E7 peptides.
Therapeutic and prophylactic vaccine efficacy was analysed in an in vivo mouse challenge model using HPV16-transformed TC-1 tumour cells. Animals that were vaccinated twice s.c. and challenged with TC-1 cells 10 days after the boost either did not develop any tumours or showed significantly decreased tumour growth rates as compared to mock or empty influenza vector treated animals. Similar results were obtained in a more stringent therapeutic setting, in which animals were primed s.c. with H1N1 recombinant virus inoculated s.c. with TC-1 the same day, and boosted with the recombinant H3N2 serotype 10 days later. Additional vaccine administration routes were analysed using intranasal and intratumoral application, with the latter inducing complete tumour regression in a subset of mice and significantly decreasing tumour growth rates in additional animals.
These results suggest recombinant E6E7 influenza viruses as a promising new tool to develop therapeutic vaccination strategies against HPV-induced high-grade intraepithelial lesions.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
therapeutic vaccination HPV Influenza cervical cancer
Schlagwörter
(Deutsch)
therapeutische Vakzine humanes Papillomvirus Influenza Zervixkarzinom
Autor*innen
Christoph Jindra
Haupttitel (Englisch)
Generation of an influenza A based therapeutic human papillomavirus type 16 vaccine
Paralleltitel (Deutsch)
Generierung einer Influenza A basierten therapeutischen Vakzine gegen humanes Papillomvirus Typ 16
Publikationsjahr
2015
Umfangsangabe
X, 82 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Dieter Blaas ,
Richard Roden
Klassifikationen
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
42 Biologie > 42.32 Virologie
AC Nummer
AC12230606
Utheses ID
32442
Studienkennzahl
UA | 091 | 490 | |