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Impacts of human LDLR overexpression on the production of a VSVG-pseudotyped lentiviral vector
Alexander Otahal
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Biologie
Betreuer*in
Dieter Blaas
DOI
10.25365/thesis.36614
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30246.38435.131261-0
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Der Titer eines HIV1-basierten VSVG-pseudotypisierten lentiviralen Vektors produziert in
HEK293 Zellen wird abhängig von der Expression humanen LDL-Rezeptors (LDLR) vermindert.
Im Gegensatz dazu, Ko-Expression von ICAM-1 oder TfR1 reduziert die Vektorproduktion nicht.
Reverse Transkription und quantitative PCR (RT-qPCR) enthüllte eine Verminderung der
Ausbeute an Vektor RNA statt einer Reduktion der spezifischen Infektivität der Vektorpartikel.
Fluoreszenzmikroskopie lebender Zellen zeigte verminderte Syncytium-Bildung von HEK293
Zellen während der Vektorproduktion, was auf reduzierte Zelloberflächenexpression von VSVG
schließen lässt. Ko-Expression von LDLR Deletionskonstrukten statt Wildtyp-LDLR, denen
entweder das Signalpeptid (LDLR-ΔSP), die Ligandenbindungsdomäne (LDLR-ΔLBD) oder das
Internalisierungssignal (LDLR-ΔNPVY) fehlt, veranschaulicht, dass die Ligandenbindungs-
domäne von LDLR verantwortlich für die reduzierte VSVG Zelloberflächenexpression ist, was
mit vermindertem Vektortiter korrespondiert. Das Expressionsniveau von VSVG bleibt
unverändert, wie eine Western Blot Analyse ergab. Ebenso zeigte die Kopiezahl an VSVG mRNA
nur insignifikante Unterschiede in An- und Abwesenheit von LDLR laut RT-qPCR. Daher wird
auch transkriptionelles Feeback auf die VSVG-Expression ausgeschlossen. Kolokalisierung von
VSVG mit Markern verschiedener intrazellulärer Kompartimente (ERGIC53, GM130, LAMP2)
sowie LDLR selbst mittels indirekter Immunofluoreszenz deckte intrazelluläre Umleitungs-
prozesse auf. VSVG-positive vesikuläre Strukturen kolakalisierten mit ERGIC53 und LAMP2
sowie LDLR, aber nicht mit GM130. Finkelshtein und Kollegen (2013) konnten kürzlich zeigen,
dass LDLR ein Wirtszellrezeptor für VSVG ist. Daher könnte die Überexpression von LDLR und
VSVG während der Vektorproduktion zu deren intrazellulären Interaktion führen, was Protein-
Qualitätskontrollmechanimen auslösen könnte, die VSVG-LDLR Komplexe oder Aggregate zu
Lysosomen umleiten anstatt das Fortschreiten auf dem Sekretionsweg durch den Golgi zu
erlauben.
Abstract
(Englisch)
The titer of a HIV1-based VSVG-pseudotyped lentiviral vector produced in HEK293 cells
decreases as a function of LDLR over-expression. In contrast, co-expression of either ICAM-1 or
TfR1 does not reduce vector production. Reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR)
revealed a decrease in vector RNA yield rather than a reduction of the specific infectivity of
vector particles. Live-cell fluorescence microscopy showed decreased syncytia formation of
HEK293 cells during vector production suggesting reduced surface expression of VSVG. Co-
expression of LDLR deletion constructs instead full length LDLR lacking either the signal
peptide (LDLR-ΔSP), the ligand-binding domain (LDLR-ΔLBD) or the internalisation signal
(LDLR-ΔNPVY) demonstrated that the ligand-binding domain of LDLR is responsible for
decreased VSVG surface expression which corresponded with decreased vector titer. VSVG
protein expression levels were unaffected, as shown by Western Blot analysis. Similarly, the
copy number of VSVG mRNA showed only insignificant differences in presence and absence of
LDLR according to RT-qPCR, therefore transcriptional feedback onto VSVG expression was
excluded. Colocalisation of VSVG with markers of intracellular compartments (ERGIC53, GM130,
LAMP2) and LDLR, respectively, was assayed via indirect immunofluorescence to uncover
intracellular rerouting processes. Dense VSVG-positive spherical structures were found
colocalizing with ERGIC53, LAMP2 and LDLR, but not with GM130. Previously, Finkelshtein and
colleagues (2013) identified LDLR as a host-cell receptor for VSVG. Thus, the over-expression of
both, LDLR and VSVG, during vector production could lead to their intracellular interaction,
which could trigger a type of unfolded protein response redirecting the transport of VSVG-LDLR
complexes or aggregates to lysosomes instead the Golgi.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
gene therapy VSVG familial hypercholesterolaemia
Schlagwörter
(Deutsch)
Gentherapie VSVG Familiäre Hypercholesterinämie
Autor*innen
Alexander Otahal
Haupttitel (Englisch)
Impacts of human LDLR overexpression on the production of a VSVG-pseudotyped lentiviral vector
Paralleltitel (Deutsch)
Einflüsse der Überexpression von humanem LDLR auf die Produktion eines VSVG-pseudotypisierten lentiviralen Vektors
Publikationsjahr
2015
Umfangsangabe
53 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Dieter Blaas
Klassifikationen
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
42 Biologie > 42.32 Virologie
AC Nummer
AC12247157
Utheses ID
32456
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |