Detailansicht
Understanding the pathogenicity of mycoplasma agalactiae through In vitro and In vivo infection studies
Shivanand Hegde
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
PhD-Studium (Doctor of Philosophy) (Dissertationsgebiet: Biologie)
Betreuer*innen
Renate Rosengarten ,
Matthias Horn
DOI
10.25365/thesis.36635
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29394.46789.154759-0
Link zu u:search
(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Mycoplasma agalactiae ist ein wichtiger bei kleinen Wiederkäuern vorkommender Krankheitserreger, dessen Pathogenesemechanismen auf dem molekularen Level jedoch weitgehed unverstanden sind, da bis vor kurzem ein Mangel an Möglichkeiten bestand, M. agalactiae genetisch zu manipulieren. In der vorliegenden Arbeit wurden Pathogenitätsdeterminanten von M. agalactiae durch In vitro- und In vivo- Screeningexperimente anhand von 200 sequenzierten Transposon-Mutanten identifiziert. Pools aus ausgewählten Mutanten wurden im Schaf-Infektionsmodell unter Anwendung der intramammären Infektionsroute auf Attenuierung einzelner Mutanten geprüft. Dazu wurden die für die Infektion verwendete Mutantenpopulation und die reisolierte Mutantenpopulation mittels Signatur-Sequenz-Mutagenese als Negativselektionsmethode verglichen.
Während eines initialen In Vivo-Screeningexperiments wurden insgesamt 14 Mutanten identifiziert und ihre Attenuierung in einem zweiten Infektionsexperiment aufgrund ihrer 100%igen Abwesenheit unter den Reisolaten bestätigt. Unter den attenuierten Mutanten befanden sich 7 Mutanten mit Insertionen in den Genen MAG1050, MAG2540, MAG3390, uhpT, eutD, adhT und MAG4460, die verschiedenen Funktionsklassen einschließlich hypothetischen Genen zugeordnet sind, deren pathogenetische Rolle bei M. agalactiae bisher unbekannt war.
Im Rahmen der In vitro-Untersuchungen wurden unter Einsatz verschiedener Zelllinien Wachstumsprofile erstellt sowie Zellinvasions-, Ko-Kultivierungs- und Zytotoxizitätsstudien durchgeführt, anhand derer eine wichtige Rolle einzelner Gene aufgezeigt werden konnte. Diese wichtigen Funktionen konnten bei einigen Mutanten auch durch Komplementationsstudien unter Anwendung eines neu-entwickelten Expressionsvektors bestätigt werden. Darüber hinaus haben diese Untersuchungen erstmalig die Zellinvasionsfähigkeit von M. agalactiae nachgewiesen, und zwar sowohl in vitro im Zellkultursystem wie auch in vivo im Schaf-Infektionsmodell. Die Detektion von M. agalactiae im Zyotoplasma von Epithelzellen und in Makrophagen ist der erste formale Nchweis der Befähigung von M. agalactiae zur Translokation des mammären Epitheliums und nachfolgender systemischen Disseminierung unter Einbeziehung entfernt liegender innerer Organe, eine mögliche Erklärung für die Persistenz dieses Erregers und für die Chronizität der durch ihn hervorgerufenen Erkrankung.
Insgesamt konnten im Rahmen dieser Arbeit viele verschiedene für die Pathogenese relevante Faktoren von M. agalactiae identifiziert werden, wodurch eine mögliche Basis gelegt wurde, erfolgreiche Bekämpfungs- und Präventionsstrategien zu entwickeln.
Abstract
(Englisch)
Mycoplasma agalactiae is an important pathogen of small ruminants, but the molecular basis of its pathogenesis is largely unknown. This lack of knowledge is mainly attributed to the previous lack of tools to genetically manipulate this agent. In the current study, pathogenicity determinants of M. agalactiae were identified by in vitro and in vivo screening of a Tn-mutant library of 200 sequenced mutants. Following extensive in vitro studies, pools of selected mutants were injected into lactating sheep via the intramammary route. The injected mutant population was compared with the recovered population to identify the attenuated mutants by using a negative selection method called Signature Sequence Mutagenesis. A total of 14 mutants were identified during initial screening in sheep and were then confirmed for 100% absence in a second round of sheep infection studies that were carried out in triplicate. The latter identified 7 mutants with insertions in MAG1050, MAG2540, MAG3390, uhpT, eutD, adhT, and MAG4460. Importantly, the attenuated mutants belong to different functional classes including many hypothetical genes implying their previously unknown role in M. agalactiae pathogenicity.
The in vitro analysis comprised growth profiles, cell invasion studies, co-cultivation and cytotoxicity studies in mammalian cell lines, revealing an important role of certain genes, as also confirmed for some mutants by complementation studies using a newly developed expression vector. These studies demonstrated for the first time M. agalactiae’s ability to invade cultured mammalian cells. Furthermore, cell invasion was also demonstrated in vivo during experimental sheep infection. The detection of M. agalactiae in the cytoplasm of epithelial cells and macrophages clearly provided the first formal proof of M. agalactiae’s capability to translocate across the mammary epithelium and systemically disseminate to distant inner organs, a possible explanation for its persistence and the chronicity of disease caused by this agent.
Altogether, this study has identified many different factors involved in M. agalactiae pathogenesis and has provided a potential basis in developing successful intervention and prevention strategies.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Mycoplasma agalactiae Invasion SSM PCR Transposon Mutagenesis
Schlagwörter
(Deutsch)
Mycoplasma agalactiae Invasion SSM PCR Transposon-Mutagenese PDHB
Autor*innen
Shivanand Hegde
Haupttitel (Englisch)
Understanding the pathogenicity of mycoplasma agalactiae through In vitro and In vivo infection studies
Paralleltitel (Deutsch)
Das Verständnis der Pathogenität von Mycoplasma agalactiae durch in vitro und in vivo Infektionsstudien
Publikationsjahr
2014
Umfangsangabe
169 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Gerold Stanek ,
Enno Jacobs
AC Nummer
AC12245998
Utheses ID
32476
Studienkennzahl
UA | 094 | 437 | |