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Combining Raman microspectroscopy and heavy water (D 2 O) to identify the active members in microbial communities with single cell resolution
Esther Mader
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Ökologie
Betreuer*in
Michael Wagner
DOI
10.25365/thesis.36791
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29726.60022.106761-1
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Mikrobielle Gemeinschaften sind essentiell für die Funktion aller Ökosysteme, dennoch ist das Wissen über ihre komplexen Interaktionen und Abhängigkeiten begrenzt. Methoden um den Metabolismus und die Aktivität von Mikroorganismen, unabhängig von Isolierung und Kultivierung zu untersuchen basieren oft auf der Zugabe von isotopenmarkierten Substraten in Kombination mit molekularen Techniken.
Im Zuge dieser Studie wurde die Verwendbarkeit von Deuteriumoxid (D2O) als genereller Aktivitätsmarker in Kombination mit Raman Mikrospektroskopie getestet. Die Einlagerung von schweren Isotopen führt zu einer Verschiebung der entsprechenden Peaks in den Raman Spektren. Erste Experimente mit bakteriellen Reinkulturen, gezüchtet in Medium mit verschiedenen D2O Konzentrationen zeigten eine deutliche und reproduzierbare Verschiebung des Kohlenwasserstoffbindungen zugeschriebenen Peaks. Die Intensität dieses spezifischen CD Peaks in den Raman Spektren korrelierte mit der D2O Konzentration im Umgebungswasser. Die Aufnahme des Isotops in die Zellmasse wurde zusätzlich mit NanoSIMS Messungen bestätigt welche zeigten, dass 0,17 at% Deuterium in der Zellmasse ausreichen um markierte Zellen nachzuweisen. Dies entspricht einem Detektionlimit von unter 8 %CD in den Raman Spektren von allen getesteten Spezies. D2O wurde oft als toxisch für Zellen beobachtet, daher wurde der Einfluss des Isotops auf das Zellwachstum ermittelt. Wachstumskurven von drei bakteriellen Stämmen zeigten, dass bis zu einer Konzentration von 50% D2O des Umgebungswassers keine signifikante Reduktion des Zellwachstums festgestellt werden kann. Die Reaktion auf die Zugabe von D2O in das Wachstumsmedium war nicht konsistent für alle Spezies, die autotrophen Archaeen wiesen eine deutlich höhere Assimilationsrate auf als die heterotrophen Bakterienstämme. Dies kann dadurch erklärt werden, dass während autotrophe Organismen den gesamten Wasserstoff direkt aus dem Wasser beziehen, heterotrophe Zellen zusätzlich Wasserstoff von verschiedenen Substraten aufnehmen. In Folge dessen ist eine exakte Quantifizierung der Aktivität, basierend auf der D-Markierung nicht möglich. Zur weiteren Evaluierung der Verlässlichkeit der Methode wurde die Lagerungsstabilität und der Einfluss der Fluoreszenz in situ Hybridisierung auf die Intensität der D-Markierung untersucht. Während die Lagerung keinen signifikanten Einfluss hatte, führte die Hybridisierung zu einer Verringerung der Intensität der D-Markierung von durchschnittlich 42%.
Die Anwendbarkeit dieses Prinzips wurde anhand der Darmflora von Mäusen getestet, welche mit 50% D2O und verschiedenen Substraten inkubiert wurde. Die Aktivität innerhalb der Gemeinschaft konnte so beobachtet und aktiv wachsende Zellen identifiziert werden. Zusätzlich wurde die Möglichkeit verschiedene Stoffwechselwege innerhalb der Gemeinschaft nachzuweisen, durch die Kombination von Raman Messungen mit D2O und verschiedenen spezifischen Substraten demonstriert. A. muciniphila und B. acidifaciens wurden gezielt mittels FISH ausgewält und ihre Reaktion auf die Zugabe der Substrate verfolgt. Während B. acidifaciens von allen zugegeben Substraten gleichermaßen stimuliert wurde, wurde A. muciniphila fast ausschließlich durch die Zugabe von Mucin angeregt. Das ist konsistent mit Berichten zur unterschiedlichen Nährstoffverwertung dieser Arten. Diese Ergebnisse demonstrieren die erfolgreiche Entwicklung eines Protokolls zur Detektion der Deuteriumassimilation aus D2O in Mikroorganismen in komplexen Gemeinschaften mittels Raman Mikrospektroskopie.
Abstract
(Englisch)
Microbial communities are vital for the function of all ecosystems. Nevertheless the knowledge about their complex interactions and dependencies is limited. Methods to study the metabolism and activity patterns of microbes independent from isolation and cultivation are often based on the amendment with isotopically labeled substrates in combination with molecular techniques.
In this study the application of deuterium oxide (D2O) as a general activity marker in combination with Raman microspectroscopy was tested. The incorporation of heavy isotopes leads to a shift of the corresponding peak in Raman spectra. Initial experiments with various pure cultures grown in the presence of different concentrations of D2O showed a clear and reproducible red shift of the (mostly lipid related) Carbon-Hydrogen bond peak induced by D2O. The intensity of this signature CD peak in the Raman spectra was correlated to the D2O concentration in the growth water, and the incorporation of the isotope in the microbial cell mass was also confirmed by NanoSIMS measurements. These showed that 0.17 at% D in the cell mass is sufficient for the detection of labeled cells. This corresponds to a detection limit below 8%CD in Raman spectra of all tested strains. As D2O was often observed to have a toxic effect on living cells, the influence of different concentrations of D2O on cell growth was investigated. Growth curves of three bacterial strains demonstrated that up to a concentration of 50% D2O in the growth medium no significant inhibition occurs. The reaction to the addition of D2O to the growth medium was not consistent for all species, and the autotrophic archaea had a considerable higher incorporation rate compared to the heterotrophic bacteria. This can be explained by the fact that while autotrophic organisms derive all hydrogen from water, heterotrophic cells incorporate additional H from different substrates. As a consequence exact quantification of activity based on the CD peak is not possible. To further evaluate the reliability of the approach, tests concerning the storage stability and the influence of the FISH protocol on the deuterium label were conducted. While the storage had no significant influence on the intensity of the D label the FISH procedure decreased the %CD at an average of 42%.
In a proof of principle experiment the mouse cecum community was incubated with 50% D2O and amended with different substrates. The activity within the community could be observed and actively growing cells were identified. Further the possibility of detecting different metabolic pathways in a complex community was demonstrated by combining Raman measurements with D2O and other specific substrates. A. muciniphila and B. acidifaciens were specifically targeted with FISH and their response to the amendment of the different substrates was detected. While B. acidifaciens was stimulated equally by all substrates A. muciniphila was nearly exclusively stimulated by the addition of mucin. This supports the differences in substrate utilization patterns reported for these species. These results demonstrate the successful establishment of a protocol to detect D assimilation from D2O in microbial cells of a diverse community by Raman microspectroscopy.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Raman microspectroscopy D2O activity single cell microbiology gut microbiota
Schlagwörter
(Deutsch)
Raman Mikrospektroskopie D2O Aktivität Einzelzell Mikrobiologie Darmflora
Autor*innen
Esther Mader
Haupttitel (Englisch)
Combining Raman microspectroscopy and heavy water (D 2 O) to identify the active members in microbial communities with single cell resolution
Paralleltitel (Deutsch)
Kombination von Raman Mikrospektroskopie und schwerem Wasser (D2O) zur Identifikation von aktiven Mitgliedern einer mikrobiellen Gemeinschaft mit Einzelzellauflösung
Publikationsjahr
2015
Umfangsangabe
53 S. : graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Michael Wagner
AC Nummer
AC12273233
Utheses ID
32608
Studienkennzahl
UA | 066 | 833 | |