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Characterization of antibodies recognizing the alpha 5 subunit of nicotinic acetylcholine receptors
Christoph Zlabinger
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Biologie
Betreuer*in
Petra Scholze
DOI
10.25365/thesis.37223
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30259.77968.543761-8
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Unser Ziel war es, spezifische Antikörper gegen die alpha-5-Untereinheit des nikotinischen Acetylcholinrezeptors (nAChR) herzustellen, die in Immunopräzipitation und Immunzytologischen Methoden anwendbar sind. Zusätzlich wurde mit spezifischen Antikörpern gegen Alpha2, Alpha3, Alpha4, Alpha5, Alpha6, Beta2 und Beta4 die Untereinheit-Zusammensetzung von nAChRs im Interpeduncular nucleus (IPN) von wild-typ, Beta2-knockout and Beta4-knockout Mäusen bestimmt.
In heterologem Gewebe ergaben sowohl Immunopräzipitationen als auch die Färbungen spezifische und quantitativ korrekte Ergebnisse. In nativem Gewebe hingegen ergaben die Immunopräzipitationen, obwohl sie spezifisch waren, nur 30-50% der Referenzwerte. Die Immunozytochemischen und Immunohistochemischen Färbungen zeigten im heterologen Gewebe spezifisches Signal; im nativen Gewebe allerdings war keine spezifische Färbung möglich.
Die Rezeptorzusammensetzung des IPNs in der Maus wurde mithilfe des gut charakterisierten Alpha5S23 Antikörpers untersucht: Alpha2 39.15 ± 3.18 fmol/mg Proteinlysat; Alpha3 174.16 ± 17.35 fmol/mg Proteinlysat; Alpha4 139.40 ± 8.40 fmol/mg Proteinlysat; Alpha5 30.57 ± 1.32 fmol/mg Proteinlysat; Alpha6 9.84 ± 0.58 fmol/mg Proteinlysat; Beta2 183.87 ± 13.20 fmol/mg Proteinlysat; Beta4 161.37 ± 21.77 fmol/mg Proteinlysat.
Mithilfe der Alpha5, Beta2 und Beta4-Knockout Geweben konnten wir Rückschlüsse auf die Koassemblierung der Rezeptoren ziehen, unter der Annahme , dass keine Kompensationsmechanismen für Knockout Untereinheiten stattfinden. Unter diesen Vorraussetzungen sahen wir, dass Alpha2, Alpha4, Alpha5 und Alpha6 mit Beta2, und Alpha3 mit Beta4 koassemblieren wenn sie einen Rezeptor bilden.
Abstract
(Englisch)
Our aim was to generate subunit specific antibodies against the alpha5 nAChR subunit, capable of performing in Immunoprecipitation, Immunohistochemical and Immunocytochemical staining methods. Additionally with specific antibodies against alpha2, alpha3, alpha4, alpha5, alpha6, beta2 and beta4 subunits, the nAChR subunit composition of wild-type, alpha5-knockout, beta2-knockout and beta4-knockout mouse interpeduncular nucleus (IPN) should be revealed.
In heterologous tissue both techniques Immunoprecipitation and Immunocytochemistry yield specific and quantitatively correct results. However in native tissue Immunoprecipitation proved high specificity of the antibodies but the precipitated receptor amount was only 30-50% of the reference antibody. In Immunocytochemical and Immunocytochemical studies only heterologous tissue could be stained specifically.
Additionally using the previously generated and excellently working antibody alpha5S23 the wild-type mouse IPN nAChR-subunit composition with focus on alpha5 containing receptors was successfully identified: alpha2 39.15 ± 3.18 fmol/mg lysate protein; alpha3 174.16 ± 17.35 fmol/mg lysate protein; alpha4 139.40 ± 8.40 fmol/mg lysate protein; alpha5 30.57 ± 1.32 fmol/mg lysate protein; alpha6 9.84 ± 0.58 fmol/mg lysate protein; beta2 183.87 ± 13.20 fmol/mg lysate protein; beta4 161.37 ± 21.77 fmol/mg lysate protein.
With the investigation of subunit changes in alpha5, beta2 and beta4-knockout tissue we could conclude with the presumption of no compensation mechanisms, that alpha2, alpha4, alpha5 and alpha6 co-assemble with beta2 and alpha3 co-assembles with beta4.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
nAChR Alpha 5 antibody IPN SCG subunit composition
Schlagwörter
(Deutsch)
naChR Alpha 5 Antikoerper IPN SCG Zusammensetzung
Autor*innen
Christoph Zlabinger
Haupttitel (Englisch)
Characterization of antibodies recognizing the alpha 5 subunit of nicotinic acetylcholine receptors
Paralleltitel (Deutsch)
Charakterisierung von spezifischen Antikörpern, welche gegen die Alpha-5-Untereinheit des nikotinischen Acetylcholinrezeptors gerichtet sind.
Publikationsjahr
2015
Umfangsangabe
72 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Petra Scholze
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC12283971
Utheses ID
32993
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |