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Development and validation of a multiplex real-time PCR method for the simultaneous detection of white, black and brown mustard and celery in food
Monika Palle-Reisch
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Dr.-Studium der Naturwissenschaften (Dissertationsgebiet: Chemie)
Betreuer*in
Margit Cichna-Markl
DOI
10.25365/thesis.37309
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30055.28696.424763-0
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Senf- und Sellerieallergien sind in Europa relativ weit verbreitet. In Frankreich leiden ca. 1-7%
aller Lebensmittelallergiker an einer Senfallergie und in der Schweiz sind ca. 30-40% aller
Patienten gegenüber Sellerie sensibilisiert. Da nach wie vor an Therapien für
Lebensmittelallergien geforscht wird, bleibt den betroffenen Personen nur die Option das
allergieauslösende Lebensmittel strikt zu vermeiden. Um Lebensmittelallergiker zu schützen,
unterliegen in Europa dreizehn potentiell allergene Lebensmittel, darunter auch Senf und
Sellerie, einer Kennzeichnungspflicht (Directive 2007/68/EC).
Für die Überprüfung der Einhaltung der Kennzeichnungspflicht von Allergenen in
Lebensmitteln werden selektive und sensitive Analysenmethoden benötigt. Gegenwärtig
spielen protein-basierende und DNA-basierende Methoden die wichtigste Rolle in der
Lebensmittelanalytik. Es wurden bereits einige real-time PCR Methoden für die Detektion von
Senf und Sellerie publiziert. Jene für Senf weisen jedoch Kreuzreaktivität vorwiegend mit
anderen Brassicaceae Spezies auf. Lebensmittel können weißen Senf, schwarzen Senf
und/oder braunen Senf und drei unterschiedliche Selleriearten enthalten. Da viele
kommerzielle Lebensmittel, wie Fleischprodukte, Soßen, Marinaden und Fertiggerichte,
sowohl Senf als auch Sellerie beinhalten können, setzten wir uns, in Zusammenarbeit mit Mag.
Rupert Hochegger, Abteilung Molekular- und Mikrobiologie, Institut für
Lebensmittelsicherheit Wien, Österreichische Agentur für Gesundheit und
Ernährungssicherheit (AGES), die Entwicklung einer Mulitplex Methode für die simultane
Detektion aller drei Senfspezies und Sellerie zum Ziel.
Wir starteten mit der Entwicklung einer real-time PCR Methode für die gleichzeitige Detektion
von schwarzem und braunem Senf. Die entworfenen Primer und die Sonde erfassen eine
Sequenz des Gens „Brassica nigra encoding reverse transcriptase from gypsy-like
retroelement 13G42-26“. Diese Methode wurde mit einer real-time PCR Methode für weißen
Senf, welche in unserer Arbeitsgruppe entwickelt wurde, kombiniert. Zum Schluss wurde die
neue Duplex real-time PCR Methode für weißen, schwarzen und braunen Senf mit einer
Singleplex real-time PCR Methode für Sellerie (in unserer Arbeitsgruppe entwickelt) zu einer
Triplex real-time PCR Methode für die simultane Bestimmung aller drei Senfspezies und drei
Selleriearten erweitert.
Jede real-time PCR Methode wurde durch Analyse von seriell verdünnten Mischungen von
DNA Extrakten aus weißem, schwarzem oder braunem Senf, und Sellerie validiert. Zusätzlich wurden Modellwürste mit definierten Mengen an Senf und Sellerie produziert. Um die
Anwendbarkeit der Methoden auf stark verarbeitete Lebensmittel zu prüfen, wurden rohe
und gebrühte Modellwürste analysiert.
Die real-time PCR Methoden für schwarzen/braunen Senf zeigen keine Kreuzreaktivität mit
anderen Brassicaceae Spezies. Geringe Kreuzreaktion wurde mit Kümmel, Kreuzkümmel,
Bockshornklee und Ingwer erhalten, doch verglichen zur Positivkontrolle war die Differenz des
Ct Wertes ≥ 12. Alle im Rahmen dieser Doktorarbeit entwickelten real-time PCR Methoden
sind hoch sensitiv, mit Nachweisgrenzen im Bereich von 10 bis 100 mg/kg allergenes
Lebensmittel. Die real-time PCR Methoden wurden zur Überprüfung der korrekten
Kennzeichnung von kommerziellen Lebensmitteln mit unterschiedlicher Deklaration
hinsichtlich Senf und Sellerie eingesetzt.
Zusätzlich verglichen wir die Anwendbarkeit der „in-house“ entwickelten real-time PCR
Methoden, Singleplex für schwarzen/braunen Senf, Singleplex für weißen Senf und Duplex für
alle drei Senfspezies, mit zwei kommerziellen Senf ELISA Kits (einen für die Detektion aller drei
Senfspezies, ein anderer spezifisch für weißen Senf). Die Validierung der Methoden wurde
durch die Analyse von rohen und gebrühten Modellwürsten, welche 1 bis 50 mg/kg weißen
Senf sowie braunen oder schwarzen Senf beinhalteten, durchgeführt. Generell waren die
kommerziellen ELISAs empfindlicher als die real-time PCR Methoden. Dennoch zeigen unsere
Ergebnisse, dass sowohl die ELISAs als auch die drei real-time PCR Methoden für die Detektion
von Spuren von Senf nicht nur in rohen sondern auch in gebrühten Würsten eingesetzt werden
können.
Abstract
(Englisch)
Allergies to mustard and celery are rather prevalent in Europe. In France, about 1-7% of all
food allergic persons suffer from mustard allergy and in Switzerland, 30-40% of the patients
are sensitised to celery. Since therapies of food allergies are still under research, the only
option for concerned individuals is the strict avoidance of the responsible food. In order to
protect food allergic patients, in Europe thirteen potentially allergenic foods, including
mustard and celery, have to be declared on commercial food products (Directive 2007/68/EC).
Selective and sensitive analytical methods are necessary to be able to verify if foodstuffs are
labelled according to legal regulations. Currently, protein-based and DNA-based methods play
the most important role in food allergen analysis. Several real-time PCR methods for the
detection of mustard or celery have already been published. However, all real-time PCR
methods for mustard show some cross-reactivity, mainly with other Brassicaceae species.
Food products may contain white mustard, black mustard and/or brown mustard and three
different celery varieties. Since in many commercial foodstuffs, such as meat products, sauces,
marinades or convenience products, both mustard and celery can be present, in cooperation
with Mag. Rupert Hochegger, Department of Molecular Biology and Microbiology, Institute
for Food Safety, Austrian Agency for Health- and Food Safety (AGES), we aimed to develop a
multiplex assay allowing the simultaneous detection of all three mustard species and celery.
We started with the development of a real-time PCR method for the simultaneous detection
of black and brown mustard. The primers and the probe were designed to target a sequence
of the “Brassica nigra gene encoding reverse transcriptase from gypsy-like retroelement
13G42-26”. This method was then combined with a real-time PCR assay for white mustard,
which has been developed previously in our research group. Finally, the novel duplex realtime
PCR assay for white, black and brown mustard was extended with a singleplex real-time
PCR assay for celery (previously developed in our research group) to a triplex real-time PCR
assay for the simultaneous detection of all three mustard species and three celery varieties.
Each real-time PCR assay was validated by analysing serially diluted mixtures of DNA extracts
from white and black or brown mustard and celery. In addition, model sausages containing
defined amounts of mustard and celery were produced in-house. In order to investigate the
applicability of the real-time PCR assays to processed foods, raw and brewed model sausages
were analysed. The real-time PCR assays for black/brown mustard do not show cross-reactivity with other
Brassicaceae species. Low cross-reactivity was observed with caraway, cumin, fenugreek and
ginger, but compared to the positive control, the difference in the Ct value was ≥ 12. All realtime
PCR methods developed in course of the doctoral thesis were found to be highly
sensitive, with limits of detection (LODs) being in the range from 10 to 100 mg/kg of the
allergenic food. The real-time PCR assays were applied to verify correct labelling of
commercially available foodstuffs differing in their declaration concerning mustard and celery.
In addition, we compared the applicability of the in-house developed singleplex real-time PCR
assay for black/brown mustard, the singleplex real-time PCR assay for white mustard and the
duplex real-time PCR assay for all three mustard species with two commercial mustard ELISA
kits (one for the detection of all three mustard species, the other one being specific for white
mustard). Validation of the methods was carried out by analysing raw and brewed model
sausages containing 1 to 50 mg/kg white mustard as well as black/or brown mustard. In
general, the commercial ELISAs were found to be more sensitive than the real-time PCR
methods. However, our results indicate that the ELISAs as well as the three real-time PCR
assays can be applied to detect traces of mustard not only in raw but also in brewed sausages.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Multiplexing real-time PCR food allergens mustard celery
Schlagwörter
(Deutsch)
Multiplexing Real-time PCR Lebensmittelallergene Senf Sellerie
Autor*innen
Monika Palle-Reisch
Haupttitel (Englisch)
Development and validation of a multiplex real-time PCR method for the simultaneous detection of white, black and brown mustard and celery in food
Paralleltitel (Deutsch)
Entwicklung und Validierung einer multiplex real-time PCR Methode für die gleichzeitige Bestimmung von weißem, schwarzem und braunem Senf in Lebensmitteln
Publikationsjahr
2015
Umfangsangabe
131 S. : graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Helmut Mayer ,
Michael Murkovic
Klassifikation
35 Chemie > 35.23 Analytische Chemie: Allgemeines
AC Nummer
AC12645001
Utheses ID
33064
Studienkennzahl
UA | 791 | 419 | |