Detailansicht
The structural organization of the human telomerase
Michael Wildauer
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
PhD-Studium (Doctor of Philosophy) (Dissertationsgebiet: Molekulare Biologie)
Betreuer*in
Christina Waldsich
DOI
10.25365/thesis.37344
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29553.30747.345955-9
Link zu u:search
(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Telomerase ist ein großer Ribonucleinkomplex, dessen Aufgabe die Synthese von repetitiven Elementen am Ende der Chromosomen ist. Dadurch trägt die Telomerase zur strukturellen Integrität der Chromosomenenden, den Telomeren bei. Diese Aufgabe wird von den zwei Hauptbestandteilen der Telomerase erledigt: a) die RNA Komponente, genannt Telomerase RNA (TR) und b) dem dazugehörigen Protein, der Telomerase Reverse Transciptase (TERT). Der Telomerasekomplex kann dadurch die ständige Verkürzung der Chromosomen nach einer Zellteilung, dem sogenannten Endreplikationsproblem, verhindern und die Solllänge der Telomere erhalten. Telomerase wird dadurch zu einem wichtigen Faktor, um die Proliferationskapazität einer Zelle zu erhalten. Einerseits ist das für sich schnell teilendes Gewebe wie blutbildende Zellen und diversen Schleimhäuten wichtig, auf der anderen Seite befähigt Telomerase auch die Entstehung von Krebszellen. Durch das Potential, sich unbegrenzt teilen zu können, und per Umgehung von natürlichen Regelmechanismen wie Apoptose und Seneszenz, kann eine gesunde Körperzelle sich zur Krebszelle entwickeln. Dieses zweischneidige Schwert macht Telomerase zu einem interessanten Ziel für Krebstherapien. Leider ist unser Wissen über die genaue Struktur und den Aufbau der Telomerase noch immer sehr eingeschränkt, da sehr viele Studien auf Daten aus in vitro Experimenten stammen und sich daher nur bedingt auf eine lebende Zelle übertragen lassen. Wir haben uns daher entschlossen, einen neuartigen Versuchsaufbau zu verwenden, der auf UV Vernetzung basiert, aber in vivo durchgeführt wird. Damit haben wir 70 Nukleotide identifiziert, die vernetzt sind. Die überwältigende Mehrheit von 46 Nukleotide befindet sich im Pseudoknoten, während sich der Rest auf die CR4/CR5 Domäne sowie die scaRNA Domäne verteilt. Wir haben gezeigt, dass die Bindung von hTERT das Vernetzungsmuster der Nukleotide im Pseudoknoten, genauer gesagt im Bereich der konservierten Dreifachhelix, signifikant beeinflusst. Die meisten Nukleotide zeigen eine Steigerung der Vernetzungsintensität, nur C104 zeigt eine Reduzierung. Diese Beobachtung lässt den Schluss zu, dass C104 einen direkten Kontakt mit dem Protein hTERT ausgebildet haben könnte und daher eine wichtige Rolle in der Bindung von hTERT an hTR spielt. Der zweite Bereich, in dem wir große Veränderungen im Vernetzungsmuster festgestellt haben, ist die konservierte CR4/CR5 Domäne. Hier spielt besonders die Helix P6.1 eine große Rolle als auch die anschließende Kreuzung J6.1/5. Das festgestellte Vernetzungsmuster legt nahe, dass die Bindung von hTERT über einen ähnlichen Mechanismus erfolgen könnte, der in Medaka identifiziert wurde. Hier findet eine komplette Umgestaltung der Dreiwegekreuzung statt und P6.1 fungiert als Schalter, je nachdem hTERT gebunden ist oder nicht. Anhand unserer Daten postulieren wir einen ähnlichen Bindemechanismus für die humane Telomerase RNA. Letztlich haben wir für die identifizierten Vernetzungen den Interaktionspartner bestimmt. Dafür haben wir mutierte hTR Konstrukte verwendet, die es uns erlaubt haben, einige räumliche Begrenzungen für das Molekül aufzustellen. Erstens zeigen unsere Daten, dass der Pseudoknoten sich in räumlicher Nähe zur Vorlage und der CR4/CR5 Domäne befindet. Diese Beobachtung ist im Einklang mit früheren Studien, die gezeigt haben, dass Nukleotid U307 für die Katalyse eine wichtige Rolle spielt. Zusätzlich postulieren wir, dass die Vernetzungen an den Nukleotiden in der scaRNA Domäne höchst wahrscheinlich zu einem der H/ACA snoRNA-Bindeproteine gehen, da wir keine Änderungen im Vernetzungsmuster feststellen konnten, unabhängig ob hTERT vorhanden war oder nicht. Zusammengefasst helfen unsere Daten, dass bereits vorhandene Modell der humanen Telomerase RNA weiter zu vervollständigen um einen noch genaueren Einblick zu erhalten.
Abstract
(Englisch)
Telomerase is a large RNP complex which adds repetitive elements to the telomeres, the ends of the chromosomes. By doing so, telomerase is responsible for the maintenance of the telomeres. The two key components responsible for this task are a) the telomerase RNA (TR) and b) the protein telomerase reverse transcriptase (TERT). The interplay of them allows telomerase to counteract the loss of information during cell division, which is due to the so-called end replication problem, while maintaining the proliferation potential of the cell. Furthermore, active telomerase permits a cell to divide itself beyond the Heyflick limit, thereby literally becoming immortal. However, unlimited as well as uncontrolled cell division is a hallmark of most cancer types known today and it is not surprising that telomerase is active in over 90% of known cancer types. Despite the bio-medical importance of telomerase, our understanding of the structure of telomerase and its mechanics is still in its infancy. We are interested in elucidating the structural conformation of human telomerase RNA (hTR) within the telomerase RNP complex. So far, most studies on telomerase have been carried out in vitro and did not take into account most of the accessory proteins present in the telomerase RNP complex. To compensate for this, we decided to use an in vivo approach. By using an in vivo UV cross-linking assay, we obtained structural information about key elements within human telomerase RNA which can be divided into three domains: a) the pseudoknot, b) the CR4/CR5 domain and c) the scaRNA domain. In total we identified 70 cross-linked nucleotides in the human telomerase RNA. With 46 cross-links the majority is located in the pseudoknot domain, in detail in the region which forms the conserved triple helix. The remainder is distributed between the CR4/CR5 domain and the scaRNA domain. Binding of hTERT strongly influences the cross-linking pattern of nucleotides in the pseudoknot region as well as in the CR4/CR5 domain. In detail, multiple nucleotides in the triple helix as well as in the corresponding linker J2b/3 show drastic changes in their cross-linking intensity. While most of the residues show an increase in cross-linking intensity in absence of hTERT, C104 is the only nucleotide for which a decrease in cross-linking intensity was observed. This makes C104 in J2b/3 a prime candidate for a direct cross-link to hTERT. For the CR4/CR5 domain, the most significant changes were observed in the P6.1 stem and the adjacent junction J6.1/5. The observed changes in the cross-linking pattern are similar to those observed in the crystal structure of mTERT bound to mTR in medaka. We therefore suggest that binding of hTERT might also lead to drastic rearrangements in the three-way junction in the CR4/CR5 domain using a similar mechanism to mTR, where P6.1 acts as a conformational switch upon mTERT binding. To identify the interaction partner of the previously identified cross-links, we created mutated hTR constructs. We were able to identify several spatial constraints for hTR. For example, we have good evidence that the triple helix is indeed formed in vivo. In addition, the template region as well as the CR4/CR5 domain is in close proximity to the pseudoknot domain. This is in good agreement with previous studies, which showed an involvement of residue U307 in catalysis. Furthermore, it is likely that the cross-links in the 5’ pocket and in scaRNA domain are directed to H/ACA snoRNA binding proteins, as we do not observe changes in the cross-linking pattern independent of hTERT. Finally, our data is in good agreement with in vivo DMS probing of hTR. In summary, our results provide new insights into the structural organization of human telomerase RNA and refine the current model of telomerase structure.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
telomerase telomere RNP TR TERT TERC TER UV-crosslinking study scaRNA snoRNA
Schlagwörter
(Deutsch)
Telomerase Telomere TR TERT UV-crosslinking
Autor*innen
Michael Wildauer
Haupttitel (Englisch)
The structural organization of the human telomerase
Paralleltitel (Deutsch)
Die strukturelle Organisation der humanen Telomerase
Paralleltitel (Englisch)
The structural organization of the human telomerase
Publikationsjahr
2015
Umfangsangabe
176 S., XI
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Craig Zirbel ,
Ivo Hofacker
AC Nummer
AC12281339
Utheses ID
33091
Studienkennzahl
UA | 094 | 490 | |