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Somatische Embryogenese bei Edelkastanie (Castanea sativa Mill.)
Ursula Erika Sauer
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Eva Wilhelm
DOI
10.25365/thesis.3765
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29563.14314.144363-4
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die Edelkastanie verzeichnete in den 70er und 80er Jahren des vorigen Jahrhunderts einen starken Rückgang sowohl bezüglich Holz- als auch Fruchtproduktion. Seit den 90er Jahren gibt es europaweit verstärkt Interesse an der Erhaltung der genetischen Ressourcen dieser Baumart und auch wieder Aufforstungsprogramme. Daher werden auch neue Methoden zur vegetativen Vermehrung von speziellen Genotypen (zum Beispiel alte Landsorten oder pilzresistente Sorten) untersucht. Die somatische Embryogenese als vegetative Vermehrungsmethode eignet sich zur Produktion von Edelkastanien im großen Maßstab und bietet somit viele Vorteile als Klonierungsmethode; für die Kryokonservierung als ex-situ Erhaltungsmöglichkeit; für die Produktion von künstlichem Saatgut oder als potentielles Verfahren zum Gentransfer.
In der vorliegenden Arbeit wurde erfolgreich ein System zur Induktion somatischer Embryogenese bei Edelkastanie entwickelt, ein Zeitfenster der Induktion bestimmt und die Multiplikation von somatischen Embryonen erreicht.
Die Embryonenausbeute der Induktion und das Entwicklungstadium des Explantats standen in engem Zusammenhang. Als optimales Stadium der Explantate zur Initiierung des Prozesses der Embryogenese wurde der Zeitpunkt mit 5-10 Wochen nach der Anthese bestimmt. Zelllinien, die 4-7 Wochen nach der Anthese induziert wurden, konnten auch in einen Zyklus der Weitervermehrung eingebracht werden. Durchschnittlich konnten in zwei Jahren 4.5% von 3.000 getesteten Explantaten embryogene Zelllinien induziert werden. Dabei war die Ausbeute bei den Ovarien (5.1 %) und bei den Samenanlagen (3 %) wesentlich niedriger als bei den jungen zygotischen Embryonen (27 %). Verglichen mit den Kotyledonen waren die Achsen die embryogen aktiveren Gewebe, was auf die Beteiligung meristematischer Zellen hinweist.
Das Vermehrungsstadium der embryogenen Kulturen erwies sich als wichtig für die Qualität der produzierten Embryonen und somit für den nachfolgenden Keimungserfolg.
21 ausgewählte Zelllinien wurden über 2 Jahre auf P24 Medium mit 0.89 µM 6-Benzylaminopurin weitervermehrt. Dabei war eine ständige Trennung von embryogenen und nicht-embryogenen Geweben notwendig, da neben den sekundären Embryonen auch Kallus produziert wurde. Weiters wurde gezeigt, dass die Vermehrung der Kulturen auch auf hormonfreiem Medium möglich ist, was in Folge zu hochwertigeren weil keimungsfähigeren Embryonen und weniger Missbildungen führte.
Erste Erfolge konnten in dieser Arbeit auch bei Reifung, Keimung und Akklimatisierung erzielt werden. Pflanzen konnten ins Glashaus transferiert und erfolgreich akklimatisiert werden. Der Erhalt der embryogenen Kompetenz der induzierten Zelllinien ist wenig problematisch, das Umschalten von repetitiver Embryogenese auf Reifung und Keimung stellt hingegen eine Herausforderung dar. Stressbehandlungen (Kälte, osmotischer Stress, Trocknung) sollen bei somatischen Embryonen die Reservestoffakkumulation einleiten und die Dormanz brechen. Auf salzarmen Medien (P24, GD) mit erhöhten Agarkonzentrationen (1.1 %) konnten höhere Keimungsraten erzielt werden als auf den Referenzmedien mit 0.8 % Agar. Hormonfreies Reifungsmedium mit 6% Sorbitol und eine nachfolgende Kältebehandlung von 4°C für 8 Wochen führte zu den höchsten Keimungsraten. Es wurde gezeigt, dass der durch Sorbitolzugabe erzielte Trockenstress zur Ernte von 2- bis 3-mal mehr qualitativ hochwertiger Embryonen mit niedrigerem Frischgewicht führte als die Kontrollbehandlung.
Keimlinge wurden in Magenta GA-7 Dosen auf hormonfreiem Aktivkohlemedium bis zu einer Größe von etwa 5 cm gezogen und anschließend im Glashaus akklimatisiert.
Wie andere recalcitrante Samenpflanzen sind auch Edelkastanien sehr schwer vegetativ zu vermehren, deshalb sind in vitro Methoden zum Klonen von ausgewachsenen Bäumen mit bekannten Eigenschaften eine interessante Ergänzung zur forstlichen Vermehrung.
Die Induktion somatischer Embryogenese bei Holzpflanzen gelingt aber meist nur ausgehend von juvenilem Gewebe, insbesondere von unreifen Früchten und mit dem Gametophyt in Zusammenhang stehenden Geweben. Immerhin konnten somatische Embryonen der Edelkastanie bereits an jungen Blattgeweben von in vitro Stecklingen induziert werden [Corredoira 2002].
Um als Routineverfahren für die Massenproduktion von Klonen einsetzbar zu sein, sind vor allem bei Reifung, Keimung und Akklimatisierung weitere Optimierungsarbeiten nötig. Als Basis dazu sind Untersuchungen der Effekte veschiedener Reifungs- und Keimungs - Behandlungen mittels anatomischer, histologischer, physiologischer und molekularbiologischer Methoden nötig. Reifungsprotokolle könnten dann gezielter auf die Bedürfnisse der Embryonen abgestimmt werden.
Eine weitere Herausforderung für zukünftige Arbeiten ist es, das Potenzial zur Automatisierung auszunutzen. Dies ist oft schwer zu bewerkstelligen ist, da Flüssigkulturen für Bioreaktoren nicht erfolgreich etabliert werden konnten [Vágner 2005]. Andrade [2005] konnte für die amerikanische Edelkastanie bereits ein System für Suspensionskulturen entwickeln, das eine wesentliche Effizienzsteigerung bei der Keimlingsproduktion ermöglichte.
Trotz der hohen Kosten, die mit der Entwicklung der in vitro Methoden einhergehen, könnte ein funktionierendes System für die somatische Embryogenese den steigenden Bedarf decken, Züchtungsprogramme beschleunigen und somit einen Beitrag zur Erhaltung der Edelkastanie in unserer Kulturlandschaft leisten.
Abstract
(Englisch)
Sweet Chestnut is not only a commercially valuable tree species for nut and timber production, but also a valued element of our landscape. The traditional chestnut culture in coppices is no longer important, the demand for poles, sticks and fuel wood decline and nuts are no longer "bread of the poor". Not only the social and economic changes threatened the species in Europe in the last century; pollution, climate change and introduced pathogens were responsible for the decline of stands. A sign for the raising interest in this species was the COST Action (European Cooperation in the field of Scientific and Technical Research) G4 Multidisciplinary Chestnut research 1996 to 2001, initiated by Austria, a framework for European experts in tree physiology, pathogens, genetics and silviculture. A wide range of research topics was studied, such as basic research regarding blight, resistance to the disease and blight control, but also development of new management practice for high quality timber production, assessing genetic resources of European chestnut, breeding and mass production of trees.
The scope of this work was to develop a protocol for somatic embryogenesis (SE) in European chestnut (Castanea sativa Mill.).
During 1998 and 1999 142 SE cell lines out of 3163 juvenile explants were initiated from C.sativa, which corresponded to an overall induction frequency of 4.5%. For the first time the developmental window in which SE induction is possible was determined. The optimal stage was between 5 and 10 weeks postanthesis, cell lines initiated 4-7 weeks postanthesis could be maintained via secondary embryogenesis on P24 medium with and without 0.89 µM 6-benzylaminopurine (BA). Since proliferation media influence quality of SE and subsequently conversion frequencies and anomalous formations of SE were frequently observed on BA supplemented media, hormone free medium was preferred. In order to improve development- and maturation-conditions, experiments with increased agar (1.1%) concentration and sorbitol (6%) were performed on both hormone free and BA-media. Subsequently SE were cultivated on media without PGR and stored at 4°C, 10°C, or at room temperature. Highest embryo yield as well as highest germination frequency (40%) was achieved on hormone free media plus 6% sorbitol, after a cold treatment (8 weeks, 4°C). Germinated plantlets were transferred to Magenta GA-7 vessels containing hormone free P24-medium supplemented with 1% w/v activated charcoal. Plantlets were transferred to substrate and acclimatized in the greenhouse.
The data generated from this study and also from literature are suggesting that it is not possible to define a single, general protocol for chestnut micropropagation. Consequently, the protocol will have to be adapted to the characteristics of each cultivar. In vitro chestnut regeneration was achieved many years ago; nevertheless, large-scale propagation of chestnut species using in vitro techniques is still difficult. However, around 50 000 plants per year are produced in vitro by a company in Spain. This is the largest number of in vitro chestnut plants produced world-wide (Garcia-Nimo 1998), but it includes only several selected genotypes.
Further work is needed to elucidate the biochemical and molecular regulation of chestnut somatic embryo development with the aim of adjusting maturation and germination treatments for the production of high quality plants.
Although high costs can be involved in the development of tissue culture methods, there are several advantages of in vitro culture, such as potential for scaling up in bioreactors, cryopreservation, method for gene transfer etc. A system for somatic embryogenesis can be a useful tool integrated in traditional breeding programmes and as such be a valuable contribution for the maintenance of European chestnut in the traditional cultural landscape.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
European Chestnut Castanea sativa somatic embryogenesis micropropagation
Schlagwörter
(Deutsch)
Europäische Edelkastanie Castanea sativa Somatische Embryogenese in vitro Vermehrung
Autor*innen
Ursula Erika Sauer
Haupttitel (Englisch)
Somatische Embryogenese bei Edelkastanie (Castanea sativa Mill.)
Paralleltitel (Englisch)
Somatic embryogenesis in Castanea sativa Mill.
Publikationsjahr
2009
Umfangsangabe
82 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Eva Wilhelm
Klassifikationen
42 Biologie > 42.41 Pflanzenphysiologie ,
48 Land- und Forstwirtschaft > 48.56 Pflanzenvermehrung
AC Nummer
AC07711512
Utheses ID
3316
Studienkennzahl
UA | 438 | | |