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Role of Sprouty proteins as antagonists of RTK signaling
Christoph-Erik Mayer
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Betreuer*in
Fritz Pittner
DOI
10.25365/thesis.3776
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29982.82797.604962-3
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Krebszellen sind durch eine weitgehende Unabhängigkeit von Wachstumsfaktorstimuli und eine starke Überaktivierung von wachstums- und überlebens-promovierenden Signalübertragungssystemen gekennzeichnet. Auch die verminderte Expression der Sprouty (Spry) Proteine trägt nachweislich in malignen Tumoren verschiedener Gewebe zu diesem Phänotyp bei. In normalen Zellen fungieren die Spry Proteine, hauptsächlich über ihre hemmende Wirkung auf die Ras/Raf/MAPK Signalkaskade, als Modulatoren von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen-aktivierten Signalwegen. In dieser Arbeit konnten wir zeigen, dass die Expression von Spry2, aber nicht von Spry1, im Nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom (NSCLC) im Vergleich zum normalen adulten Lungenepithelium signifikant reduziert ist. Basierend auf dieser Erkenntnis, untersuchten wir den Einfluss der Spry2 Expression auf den malignen Phänotyp von NSCLC in Abhängigkeit von wildtyp (wt) und konstitutiv aktivem K-Ras. Während die verminderte Aktivität der MAPK Kaskade und die herabgesetzte Geschwindigkeit der Zellwanderung nach ektopischer Expression von Spry2 ausschließlich in K-Ras wt Zellen beobachtet wurde, war die Hemmung von Zellvermehrung und Tumorformation in der Maus bei der Re-expression von Spry2 unabhängig vom K-Ras Status. Die gewonnen Daten legen nahe, dass Spry2 neben der Ras/Raf/MAPK Kaskade eine zweite regulatorische Funktion wahrnimmt. Erhärtet wird diese Annahme durch Versuche mit einer Spry2 Mutante, die zwar nicht in der Lage war die Signalintensität der MAPK zu inhibieren, aber dennoch signifikant, wenn auch schwächer als Spry2 wt, die Zellvermehrung hemmte. Da alle Sprouty Proteine als Teil einer auto-regulatorischen Rückkoppelungsschleife beschrieben wurden, untersuchten wir in weiterer Folge die molekularen Grundlagen der Expressionsregulation verschiedener Spry Familienmitglieder. Erhöhte Spry2 und Spry4 Levels korrelierten signifikant mit der Expression von aktiviertem endogenen und ektopisch expremierten K-Ras in NSCLC-Zelllinien bzw. nicht-malignen Fibroblasten, während Spry1 nicht erhöht vorgefunden wurde und nicht direkt durch Ras-induzierte Signalwege reguliert wird. Durch die Verwendung verschiedener Wachstumsfaktoren und spezifischer Ras Mutationen konnten wir weiters zeigen, dass Spry2 hauptsächlich über aktivierende Ras/ Erk Signale reguliert wird, während bei Spry4 die Induktion der Spry4 Expression fast ausschließlich durch Serum angeregt und über mehrere Ras-aktivierte Signalwege beeinflusst wird. Bezüglich der Expressionsmuster während eines Zellzyklus zeigten alle untersuchten Spry Familienmitglieder phasenspezifisch fluktuierende und voneinander merklich unterschiedliche Expressionsprofile. Außerdem legen unsere Daten nahe, dass Spry1 und Spry2 über die Ebene der Transkription reguliert werden, da mRNA und Proteine übereinstimmend voneinander exprimiert vorliegen. Im Gegensatz dazu wird Spry4 eher durch post-translatorische Mechanismen stabilisiert. Über die exogene Expression von wildtyp und dominant negativem cCbl untersuchten wir den Einfluß von cCbl auf die Zellzyklusphase-abhängige Expression von Spry1, 2 und 4, v.a. zwischen später G1 und früher S Phase. Dabei konnten wir zeigen, dass die Herunterregulation von Spry2 während dieses Phasenfensters durch cCbl erfolgt, während Spry1 und Spry4 keine direkten Substrate von cCbl sind. Zusammenfassend, Spry2 wirkt der Erk Phosphorylierung entgegen und wird selbst durch Ras über den MAPK Signalweg induziert. Weiters inhibiert Spry2 die Zellproliferation über einen noch nicht beschriebenen Signalweg. Außerdem konnten wir zeigen, dass verschiedene Sprys über unterschiedliche Mechanismen in verschiedenen Zellzyklusphasen induziert werden. Auf Grund dieser Erkenntnisse liefern unsere Daten einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der Rolle von Spry Proteinen, vor allem im Hinblick auf ihre Rolle in der Krebsentstehung und -progression.
Abstract
(Englisch)
Self sufficiency of growth signals and desensitized signal transduction systems are hallmarks of human cancer. One group of proteins shown to be deregulated in malignant tumors of diverse tissues are members of the Sprouty (Spry) protein family. Sprys function as modulators of receptor tyrosine kinase (RTK) signaling mainly by interfering with the Ras/Raf/mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascade as part of an auto-regulatory feedback loop. In this study, we show that Spry2, but not Spry1 expression, is consistently lowered and significantly reduced in non small cell lung cancer (NSCLC) compared to the normal adult lung epithelium. Based on this finding, we investigated the influence of Spry2 expression on the malignant phenotype of NSCLC cells in the background of wild type (wt) or constitutive active K-Ras. Ectopic expression of Spry2 antagonized extracellular-regulated kinase (Erk) activity and cell migration just in K-Ras wt cell lines. In contrast, inhibition of cell proliferation and tumor formation in mice in response to Spry2 re-expression was observed independently of the K-Ras status. In corroboration, a Spry2 mutant unable to inhibit MAPK phosphorylation still reduced cell proliferation significantly but less pronounced compared with the Spry2 wt protein. Since all Sprouty proteins had been suggested to be regulated as part of an auto-regulatory feedback loop, further experiments were designed to explore the precise requirements for induced expression of the Spry proteins. Increased Spry2 and Spry4 levels significantly correlated with the expression of activating endogenous and ectopic expressed K-Ras muations in NSCLC cells and non-malignant fibroblasts, whereas Spry1 was not found elevated and was not regulated directly via Ras-mediated signaling cacades. Using different growth factors and ectopic expression of Ras mutant forms, our data revealed that induction of Spry2 is exclusively dependent on Erk activation via Ras-dependent signaling, while induction of Spry4 expression was almost exclusively activated by serum and/or several Ras-influenced signaling cascades. Throughout the cell cycle all investigated Spry proteins showed clear and reproducible fluctuations, but interestingly their cell cycle-specific expression patterns differed markedly. Further, we demonstrate that Spry1 and Spry2 levels are mediated by transcriptional activation, since mRNA and protein levels were found coregulated, while Spry4 is stabilized by post-translatory modifications. Finally, we investigated the influence of ectopically expressed wildtype and dominant negative cCbl on the cell cycle-specific expression of Spry1, 2 and 4, especially between late G1 and early S phase. Our data indicate that Spry2 downregulation within this specific time-frame is mediated by cCbl, whereas Spry1 and Spry4 are not direct substrates of cCbl. Summarizing, Spry2 antagonizes Erk phosphorylation and is itself induced by Ras via MAPK activation. Furthermore, Spry2 inhibits cell proliferation by another yet unidentified pathway. In addition, we showed that Sprys are induced by different mechanisms, during different phases of the cell cycle and are independently deregulated in tumor cells. Therefore our data make an important contribution to understand the role of Spry proteins.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Sprouty RTK signaling MAPK Pathway Non-small cell lung cancer
Schlagwörter
(Deutsch)
Sprouty RTK-Signalübertragungskaskaden MAPK Signalweg Nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom
Autor*innen
Christoph-Erik Mayer
Haupttitel (Englisch)
Role of Sprouty proteins as antagonists of RTK signaling
Paralleltitel (Deutsch)
Die Rolle von Sprouty Proteinen als Antagonisten von RTK-induzierten Signalübertragungskaskaden
Publikationsjahr
2008
Umfangsangabe
104 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Tesfaye Mengiste ,
Brigitte Marian
Klassifikation
42 Biologie > 42.15 Zellbiologie
AC Nummer
AC05039627
Utheses ID
3327
Studienkennzahl
UA | 091 | 419 | |