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Detection of cervical cancer derived circulating tumor cells in the peripheral blood
Markus Arnold Niebuhr
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Mikrobiologie, Mikrobielle Ökologie und Immunbiologie
Betreuer*in
Robert Zeillinger
DOI
10.25365/thesis.37673
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29261.50194.102369-1
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Das Zervixkarzinom ist die vierthäufigste Tumorentität weltweit unter weiblichen Krebspatientinnen. Nahezu alle Zervixkarzinome (99.7%) sind auf eine Infektion der Cervix
uteri mit humanen Papillomviren (HPV) zurückzuführen. Größte klinische Bedeutung
haben dabei die HPV-Genotypen HPV16 und HPV18. Mit fortschreitendem Verlauf
einer Krebserkrankung können sich einzelnen Tumorzellen abschilfern und ins Blutgefäßsystem gelangen. Diese zirkulierenden Tumorzellen (CTC) können sich in
sekundären Organen absetzen und schwer zu therapierende Mikrometastasen ausbilden. Im Fall von klinischer Rezidivierung ist eine Erkennung dieser Mikrometastasen
mittels bildgebender Verfahren schwierig. Eine Detektion von CTCs könnte daher eine
zusätzliche Methode zur Rezidivüberwachung darstellen, die eine Indikation bereits zu
einem früheren Zeitpunkt ermöglicht. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die
Entwicklung eines antigen-spezifischen Clusters zur Identifizierung von CTCs in einer
angereicherten Fraktion des Blutes von Zervixkarzinom-Patientinnen, mittels einer
parallelen fünffachen Immunfluoreszenzfärbung. Zusätzlicher Inhalt dieser Arbeit war
die Entwicklung einer computerbasierten Bildauswertung zur CTC Identifikation. Für
den Cluster wurden sechs zervixkarzinom- und ein immunzellspezifischer Marker
evaluiert. Daraus konnten zwei fünffache Immunfluoreszenzfärbungen erstellt werden,
die entweder Cytokeratin, EpCAM und HPV16 E17 (Cluster 1) oder p16, Cyclin E2 und
Cytokeratin (Cluster 2) als Zervixkarzinommarker und CD45 als Immunmarker detektieren und charakterisieren können. Die zum Zeitpunkt der Primärdiagnose entnommenen
Patientenproben (n=59) wurden unter Anwendung beider Cluster gefärbt. In 10
(16,9%) Patientinnen konnten CTCs nachgewiesen werden, wobei in 5 (8,5%) Proben
CTCs mittels Cluster 1 und in 6 (10,2%) Proben mittels Cluster 2 identifiziert wurden.
Dabei zeigte sich, dass die Marker Cytokeratin und EpCAM die höchste Spezifität und
Reliabilität aufweisen, HPV16 E7 hingegen fügt keine zusätzlichen Informationen hinzu
und beide HPV-surrogat Marker, p16 und Cyclin E2, sind nur eingeschränkt für die
CTC Detektion geeignet. Für die automatisierte Bildauswertung wurde eine Pipeline in
der Software „CellProfiler“ erstellt. Bei der Auswertung von Patientenproben resultierte
diese in einer exponentiellen Überschätzung der CTC-Anzahl. Durch eine Anpassung
der Fluoreszenz-Grenzwerte an exakte CTC-Werte konnte die Überschätzung deutlich
reduziert werden und gleichzeitig auch eine signifikante Reduktion der Falsch-PositivRate erreicht werden. Die Etablierung eines antigen-spezifischen Clusters zur Identifizierung von Zervixkarzinom-CTCs und die Realisierbarkeit einer automatisierten CTCDetektion konnten in dieser Arbeit erreicht werden. Damit konnte eine Basis für eine
mögliche Methode zu Rezidiv-Überwachung geschaffen werden.
Eine ausführliche Korrelation der erhaltenen Ergebnisse mit klinischen Daten könnte
die Prognose erlauben, ob CTCs zum Zeitpunkt der primären Diagnose einen Einfluss
auf den weiterführenden Krankheitsverlauf haben und ob die Rezidivierung früher
nachweisbar ist. Aufgrund des Zeitrahmens dieser Arbeit waren Rezidiv-Daten lediglich
in einigen Fällen vorhanden, was eine solche statistische Analyse nicht zuließ.
Abstract
(Englisch)
Cervical cancer is the fourth most common cancer in women worldwide. Almost all
cervical cancer cases (99.7%) are induced by a Human papillomavirus (HPV) infection,
whereby the genotypes HPV16 and HPV18 are of most clinical abundance. In advanced stages, tumor derived cells may invade into the vascular system. This
circulating tumor cells (CTCs) are capable of settling in secondary organs and establishing micrometastases. Often micrometastases survive clinical treatment, leading to
clinical relapse and further off scaling CTCs. In terms of clinical recurrence, micrometastases are difficult to determine by imaging methods. Therefore, the detection of
CTCs might facilitate an additional diagnostic process, capable to indicate relapse at
an earlier time point. The aim of this project was the development of a cervical cancer
antigen-specific CTC panel, which could be applied in a five-color immunofluorescence
staining for detection of CTCs in a density gradient enriched blood fraction. This would
represent an alternative for monitoring of cervical cancer patients. In addition, a computational image analysis, capable of marker-specific CTC identification should be
elaborated. To accomplish this, six CTC and one immune cell specific markers were
tested. As result two five-color immunofluorescence panels were successfully established, allowing the simultaneous detection and characterization of cervical cancer
derived CTCs via the markers: Cytokeratin, EpCAM, HPV16 E7 (panel 1) or Cytokeratin, Cyclin E2, p16 (panel 2). In addition either panel implies CD45 as panleukocyte marker. Both panels were utilized on previously processed blood samples of
59 cervical cancer patients, which were obtained at time point of primary diagnosis.
The analysis resulted in 10/59 (16.9%) of samples, where CTCs could be identified
with either one of the applied markers. Panel-wise, 5/59 (8.5%) samples were positive
for panel 1 and 6/59 (10.2%) for panel 2 markers. In 1/59 (1.7%) sample CTC detection
based on both panels was achieved. Thereby, the specificity and reliability differed
among the individual markers. Cytokeratin and EpCAM exhibited the highest reliability
and specificity, HPV16 E7 is suitable, but did not add further information and both HPVsurrogate markers, p16 and Cyclin E2, are not appropriate for a specific CTC detection.
For the automated image evaluation, a CellProfiler pipeline was developed. The application on patients’ samples resulted in an exponential overestimation of CTCs.
However, the threshold adaption to actual CTC fluorescence values attenuated the
overestimation and significantly reduced the false positive count. Generation of a cervical cancer specific marker panel for five-color immunofluorescence and the general
feasibility of an automated image evaluation could be shown in this study. Thus, the
basis of a possible relapse monitoring could be achieved.
Further evaluation of the clinical significance of the obtained results will be of high
interest, to assess a possible prognostic influence of the presence of CTCs at time of
primary diagnosis and to see whether earlier relapse diagnosis is possible. In the
course of this thesis, relapse information could only be received in a limited number of
patients due to the time frame, which does not allow a statistical analysis.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Cervical cancer Circulating tumor cell Immunofluorescence
Schlagwörter
(Deutsch)
Zervixkarzinom zirkulierende Tumorzelle Immunfluoreszenz
Autor*innen
Markus Arnold Niebuhr
Haupttitel (Englisch)
Detection of cervical cancer derived circulating tumor cells in the peripheral blood
Paralleltitel (Deutsch)
Detektion von zirkulierenden Tumorzellen des Zervixkarzinoms im peripheren Blut
Publikationsjahr
2015
Umfangsangabe
III, 70 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Robert Zeillinger
Klassifikation
44 Medizin > 44.81 Onkologie
AC Nummer
AC12318173
Utheses ID
33395
Studienkennzahl
UA | 066 | 830 | |