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Generation and characterisation of laminopathy-specific antibodies
Marko Roblek
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Egon Ogris
DOI
10.25365/thesis.3818
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29599.87644.413453-1
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Laminopathien sind eine Gruppe von Krankheiten die hauptsächlich von Mutationen in den A-typ Laminen verursacht werden. Die meisten dieser Mutationen verursachen einen Austausch von nur einer Aminosäure, die meistens autosomal-dominant vererbt werden. Die molekularen Mechanismen von Laminopathien und deren Krankheitsursache, sind aufgrund des Fehlens von spezifischen Forschungswerkzeugen, die das Studieren von den mutanten Proteinen in Patientenzellen erlauben würden, hingegen nur wenig bekannt. Basierend auf dem Ergebnis, dass die im Ogris Labor entwickelten Antikörper gegen Isoformen von Protein Phosphatase 2A (PP2A) Untereinheiten zwischen Isoformen unterscheiden können, die sich nur in einer Aminosäure des entsprechenden Epitops unterscheiden, meinten wir, dass es möglich wäre Antikörper zu entwickeln, die spezifisch das Wildtyp oder die mutanten A-typ Laminproteine, die sich nur in einer Aminosäure unterscheiden, erkennen würden. Solche Antikörper wären für die detailierte Charakterisierung des pathologischen Zustandes und zur Aufklärung der Krankheitsenstehung auf zellulärer Ebene sehr hilfreich.
Deshalb hatten wir die Absicht, monoklonale Antikörper spezifisch für autosomal-dominant Emery Dreifuss Muskuläre Dystrophie (EDMD), familiäre partielle Lipodystrophie (FPLD), und dilatierte Kardiomyopathie (DCM) verursachende Punktmutationen in den A-typ Laminen zu entwickeln, die es erlauben würden, zwischen Proteinen, die nur in einer einzigen Aminosäure verschieden sind, zu unterscheiden, um so die speziellen molekularen Eigenschaften des Wildtyp oder des mutanten Proteins zu untersuchen.
Um zu solchen Antikörpern zu gelangen wurden drei Ansätze der Antigenpräsentation angewandt. Diese inkludierten den Gebrauch von kurzen Peptiden gekoppelt an das Keyhole limpet hemocyanin (KLH) Protein, rekombinante Proteine bestehend aus der Lamin A/C C-terminalen Ig-fold Domäne fusioniert mit dem Hepatitis B Virus Core Protein (HBcAg), und rekombinante Proteine bestehend aus kurzen Peptiden, mit den gewünschten Lamin A/C Epitopen, fusioniert an HBcAg.
Die Entwicklung eines EDMD relevanten punktmutation-spezifischen Antikörpers gegen die Lamin A/C Mutante R453W war mit dem KLH-Peptid Ansatz erfolgreich. Zusätzlich wurde ein Lamin A/C Ig-fold spezifischer monoklonaler Antikörper entwickelt. Bedeutend ist auch, dass Immunisierungen mit dem rekombinanten HBcAg-lamin A/C Ig-fold R482W Fusionsprotein zu einem punktmutations-spezifischen Antikörper führten. Das deutet darauch hin, dass Immunisierungen mit einer ganzen Proteindomäne eine punktmutation-spezifische Immunantwort auslösen können.
Bedeutend ist, dass Experimente mit primären EDMD Patientenzellen zeigten, dass der neu entwickelte anti-Lamin A/C R453W Antikörper spezifisch die mutanten Proteine immunpräzipitieren, und die mutanten Proteine in der Immunfluoreszenz und im Immunblotting detektieren konnte. Mit dem anti-lamin A/C R453W Antikörper werden Funktionen der mutanten A-typ Lamine in primären Zellen von EDMD leidenden Patienten untersucht.
Abstract
(Englisch)
Laminopathies are a group of diseases caused mainly by mutations in A-type lamins. The vast majority of these mutations cause single amino acid substitutions inherited in an autosomal-dominant way. The molecular mechanisms of laminopathies and their etiology, however, are still poorly understood, mostly because of the lack of specific research tools to study the mutant proteins in patient cells. Based on the finding from the Ogris lab that antibodies against protein phosphatase 2A (PP2A) subunit isoforms can discriminate between isoforms differing only in one amino acid at the respective epitope, we thought that it would be feasible to develop antibodies recognizing specifically the wild-type or the mutant A-type lamin proteins, which are differing only in one amino acid. These antibodies would be extremely helpful for a detailed characterization of the pathological conditions and the elucidation of the disease pathogenesis at the cellular level.
Therefore we aimed to develop mouse monoclonal antibodies specific for autosomal-dominant Emery Dreifuss Muscular Dystrophy (EDMD), Familial Partial Lipodystrophy (FPLD), and Dilated Cardiomyopathy (DCM) causing point-mutations in the A-type lamins, which would allow to distinguish between proteins differing in a single amino acid, and thus to study the special molecular features of the wild-type and the mutant proteins, respectively.
To obtain such antibodies we made use of three different approaches of antigen presentation. These include the use of short peptides coupled to the keyhole limpet hemocyanin (KLH) protein, recombinant proteins consisting of the lamin A/C C-terminal Ig-fold domain fused to the Hepatitis B virus core protein (HBcAg), and recombinant proteins consisting of short peptides corresponding to the desired lamin A/C epitopes fused to HBcAg.
We were successful in developing an EDMD relevant point-mutations specific antibody against the lamin A/C mutant R453W by the KLH-peptide approach. In addition, a lamin A/C Ig-fold specific monoclonal antibody was developed. Importantly, we could also show that a recombinant HBcAg-Lamin A/C Ig-fold R482W fusion protein elicited a humoral immune response resulting in the production of lamin A/C R482W point-mutant specific antibodies, indicating that immunizations with a whole protein domain can elicit a point-mutant specific immune response.
Importantly, experiments using primary EDMD patient cells showed that the newly developed anti-lamin A/C R453W antibody could be used to specifically immunoprecipitate the mutant proteins, and to detect the mutant proteins in immunofluorescence and immunoblotting. The anti-lamin A/C R453W antibody will be used to examine the functions of the mutant A-type lamins in primary cells from EDMD patients.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
point-mutation specific antibodies laminopathies
Schlagwörter
(Deutsch)
Punktmutations-spezifische Antikörper Laminopathien
Autor*innen
Marko Roblek
Haupttitel (Englisch)
Generation and characterisation of laminopathy-specific antibodies
Paralleltitel (Deutsch)
Herstellung und Charakterisierung von Laminopathie-spezifischen Antikörpern
Publikationsjahr
2009
Umfangsangabe
138 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Egon Ogris
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC08166373
Utheses ID
3359
Studienkennzahl
UA | 490 | | |