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Structural characterization and interaction studies of myopodin isoform A with Z-disc binding partners
Bezerra Eduardo Henrique Salviano
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Doctor of Philosophy-Doktoratsstudium NAWI Bereich Lebenswissenschaften (Dissertationsgebiet: Molekulare Biologie)
Betreuer*in
Kristina Djinovic-Carugo
DOI
10.25365/thesis.38146
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29341.70731.444661-5
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Myopdin ist ein Mitglied der Podinfamilie, eine Gruppe von Proteinen, die in Muskelzellen exprimiert wird. Die Expression von Myopodin wurde in früheren Stadien der Myofibrillogenese beobachtet. In differenzierten Muskelzellen findet man Myopodin in den Z-Scheiben, wo es mit einigen fundamentalen Komponenten der Z-Scheibe interagiert wie Aktin, α-Aktinin-2 und Filamin C. Myopodin interagiert mit diesen Proteinen hauptsächlich über ihre zentrale Domäne, eine Region, die in allen Isoformen konserviert ist. Die längste in Kardiomyozyten exprimierte Isoform von Myopodin, Myopodin A, enthält auch eine PDZ-Domäne am N-Terminus. Dieser Teil von Myopodin ist verantwortlich für die Bindung an den C-Terminus von α-Aktinin-2, an das Intermediärfilament Synemin und VPS18. Das Hauptziel dieser Arbeit war, die Bindung von Myopodin mit ausgewählten Bindepartner strukturell und biochemisch zu charakterisieren um so die Funktion von Myopodin in Muskelzellen zu verstehen. Vor diesem Hintergrund war es mir möglich, Unterschiede in den Affinitäten zwischen der PDZ-Domäne von Myopodin und den C-terminalen Peptiden von Synemin, VPS18 und α-Aktinin-2 mittels ITC zu messen. Diese Komplexe wurden auch erfolgreich kristallisiert und deren Struktur gelöst. In allen Strukturen wurde die nicht-konventionelle Art der Bindung zwischen den Peptiden und der PDZ-Domäne von Myopodin beobachtet. Zusätzlich halfen diese Modelle der einzelnen Komplexe die strukturellen Determinanten aufzudecken, die verantwortlich für die unterschiedlichen Affinitäten der untersuchten Bindepartner sind. Unterstützt werden diese Ergebnisse durch Untersuchung der biophysikalischen Eigenschaften mit SEC-MALLS in sowohl reduzierender als auch oxidierender Umgebung. Es wurden auch Unterschiede in der Oligomerisierung von Myopodin beobachtet. Diese Anhaltspunkte deuten darauf hin, dass die Aktin-Bündelungsaktivität der zentralen Domäne von Myopodin von zwei unabhängigen F-Aktin Bindungsstellen verwirklicht werden. Wir verzeichneten eine Dissoziationskonstante von 2.0 µM in MST Experimenten mit der zentralen Domäne und Filamin C Ig d18-21. Allerdings wurde auch ein Regulationsmechanismus dieser Interaktion in Form von Phosphorylierung an drei Serinen von Myopodin vorgeschlagen. Um den Effekt der Phosphorylierung zu untersuchen wurden phosphorylierungsnachahmende Mutanten von Myopodin A generiert. Die Affinität des Filamin C Fragments zu der phosphorylierungsnachahmenden Mutanten sank dramatisch, was eine Herabregulierung der Interaktion durch Phosphorylierung andeutet. Basierend auf den Interaktionen mit unterschiedlichen Bindepartnern und deren unterschiedlichen Affinitäten, kann die Charakterisierung der Myopodin Interaktions-”Hotspots” die Dynamiken erklären, die Myopodin in den verschiedenen Zellvorgängen antreiben.
Abstract
(Englisch)
Myopodin is a member of the Podin family, a group of proteins widely expressed in muscle cells. Expression of myopodin has been observed at the early stages of the myofibrillogenesis process. In differentiated muscle cells myopodin is extensively found in the Z-discs, where it associates with several other fundamental components of the Z-disc, such as actin, α-actinin 2 and filamin C. Myopodin interacts with these proteins mostly through its central domain, a region conserved for all myopodin isoforms. The longest isoform of myopodin expressed in cardiomyocytes, myopodin A, possesses a PDZ domain at the N-terminus. This region of myopodin is responsible for its binding to the C-terminus of α-actinin-2, intermediate filament protein synemin and VPS18. The main aim of my thesis was to structurally and biochemically characterize the binding of myopodin to the selected binding partners and thus understand the function of myopodin in muscle cells. In this respect, by using ITC, I was able to measure differences in the affinities between PDZ domain of myopodin and C-terminal peptide of synemin, VPS18 and α-actinin 2. These complexes were successfully crystallized and their structures solved non-conventional binding of the peptide to the myopodin’s PDZ has been observed in all structures. In addition, the data obtained from X-ray structure models of the individual complexes helped to uncover the structural determinants responsible for different binding affinities of the studied binding partners. Furthermore, while studying the biochemical properties of myopodin with SEC-MALLS at reducing and oxidizing conditions, differences in oligomeric state of the myopodin were observed. As this suggests, the actin bundling activity of myopodin central domain is achieved by two independent F-actin binding sites. We observed a dissociation constant of 2.0 µM using MST experiments for myopodin central domain and filamin C Ig d18-21 complex. However, it was suggested that phosphorylation of three serine sites of myopodin central domain regulates this interaction. In order to evaluate the phosphorylation effect, a phosphomimetic mutant of the myopodin central domain was generated. The binding affinity of filamin C fragment for the mutant was found to be dramatically reduced, suggesting down-regulation of the interaction by phosphorylation. Characterization of myopodin “hot spot” interaction sites, PDZ and central domain, can explain the dynamic that drives myopodin in different cell events based on the interaction with different binding partners with different binding affinities.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Myopodin Z-disc PDZ Protein Crystallography Protein interaction
Schlagwörter
(Deutsch)
Myopodin Z-Scheibe PDZ Proteinkristallographie Protein-Wechselwirkung
Autor*innen
Bezerra Eduardo Henrique Salviano
Haupttitel (Englisch)
Structural characterization and interaction studies of myopodin isoform A with Z-disc binding partners
Paralleltitel (Deutsch)
Strukturelle Charakterisierung Und Interaktionsstudien Von Myopodin Isoform A Mit Z-Scheibe Bindepartnern
Paralleltitel (Englisch)
Structural characterization and interaction studies of myopodin isoform A with Z-disc binding partners
Publikationsjahr
2015
Umfangsangabe
123 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Matthias Wilmanns ,
Marie-Louise Bang
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC12404445
Utheses ID
33814
Studienkennzahl
UA | 794 | 685 | 490 |